Nature子刊：新技术推动CRISPR、TALEN广泛介导基因敲入

　　

生物通报道  使用一种新型的基因敲入（knock-in）技术，来自日本的科学家们将外源基因有效地插入到了人类细胞和包括蚕及青蛙在内的动物模型中。这种策略不仅能够在培养细胞中，还可以在各种生物体中普遍实现基因敲入。相关研究结果发布在近日的《自然通讯》（Nature Communications）杂志上。

当前TALENs 和CRISPR/Cas9等可编程核酸酶已被广泛应用于基因工程中，用来实现基因敲除、基因敲入和各种染色体重排（延伸阅读：Cell子刊：用CRISPR、TALEN技术实现iPS细胞治疗 ）。基因敲入通常是通过共同导入可编程核酸酶和单链寡核苷酸或是包含左右同源臂的靶向载体，诱导同源重组（HR）依赖性的基因添加来实现。

尽管同源重组介导的基因敲入能够精确插入大的DNA片段。构建靶向载体往往很费力，且在大多数培养细胞和生物体中同源重组活性都相对较低。这一问题为同源重组介导的基因敲入技术应用于生命科学领域设置了技术障碍。

与之相反，研究人员常常利用可编程核酸酶借助于微同源(microhomology)介导的末端连接(MMEJ)依赖性突变来实现基因破坏（gene disruption）。MMEJ是一种利用5–25 bp的微同源序列来介导易错配的末端连接的DNA双链断裂修复机制。在细胞周期中，MMEJ修复是在G1 /早S期活跃，而同源重组则是在晚S/G2期活跃。

在这篇新文章中，来自广岛大学科学学院的Takashi Yamamoto教授及其同事Ken-ichi T. Suzuki博士、Tetsushi Sakuma博士、Masanobu Obara教授，以及日本国立农业科学研究所的Hideki Sezutsu教授引入了一种利用TALENs 和CRISPR/Cas9技术借助微同源介导末端连接来实现基因敲入的创新策略，他们将其命名为PITCh（精确整合到靶染色体，Precise Integration into Target Chromosome）系统。

研究人员证实，TALEN介导的PITCh能够有效将外源供体DNA整合到人类细胞、蚕和青蛙染色体中的靶位点。随后研究小组进一步证实，无需携带质粒骨架序列CRISPR/Cas9介导的PITCh可以应用于人类细胞中。

这一PITCh系统适用于各种应用，包括构建疾病模型细胞和动物用于药物筛查和治疗开发。此外，研究人员预计这一基因敲入技术将提高有用重组蛋白的生产效率，例如培养动物细胞中的制药原料等。此外，这些策略还可以应用于蚕中生成功能性的重组蚕丝蛋白。该研究小组预计这一PITCh系统将提高基因组编辑技术在各种细胞和生物体中的应用，尤其是在那些因低的同源重组率而阻碍基因敲入的细胞和生物体中。

（生物通：何嫱）

生物通推荐原文摘要：

Microhomology-mediated end-joining-dependent integration of donor DNA in cells and animals using TALENs and CRISPR/Cas9

Genome engineering using programmable nucleases enables homologous recombination (HR)-mediated gene knock-in. However, the labour used to construct targeting vectors containing homology arms and difficulties in inducing HR in some cell type and organisms represent technical hurdles for the application of HR-mediated knock-in technology. Here, we introduce an alternative strategy for gene knock-in using transcription activator-like effector nucleases (TALENs) and clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR)/CRISPR-associated 9 (Cas9) mediated by microhomology-mediated end-joining, termed the PITCh (Precise Integration into Target Chromosome) system. TALEN-mediated PITCh, termed TAL-PITCh, enables efficient integration of exogenous donor DNA in human cells and animals, including silkworms and frogs. We further demonstrate that CRISPR/Cas9-mediated PITCh, termed CRIS-PITCh, can be applied in human cells without carrying the plasmid backbone sequence. Thus, our PITCh-ing strategies will be useful for a variety of applications, not only in cultured cells, but also in various organisms, including invertebrates and vertebrates.