Bio-Rad ddPCR最重要的10篇文献

【字体: 时间:2015年01月04日 来源:Bio-Rad

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  Bio-Rad的微滴式数字PCR在2011年年底正式商业化上市以来,即将进入第五个年头。该创新的技术已经得到了学术界的广泛使用与认可,截止目前在Bio-Rad的ddPCR平台上发表的文章已经接近200余篇,涉及多方面的应用。对此,我们评选出了2011~2014年在Bio-Rad ddPCR平台上发表的最重要的10篇文献,供大家参考。

  

Bio-Rad的微滴式数字PCR在2011年年底正式商业化上市以来,即将进入第五个年头。该创新的技术已经得到了学术界的广泛使用与认可,截止目前在Bio-Rad的ddPCR平台上发表的文章已经接近200余篇,涉及多方面的应用。对此,我们评选出了2011~2014年在Bio-Rad ddPCR平台上发表的最重要的10篇文献,供大家参考。同时也可以看出该新技术的生命力与应用前景。

特此声明:排名顺序与重要性无关

入选理由:第一篇基于QX100的文章,首次验证了ddPCR在CNV分析,极低含量点突变检测方面的可应用性。在后续ddPCR的相关文献中具有极高的引用率。

文章标题:High-throughput droplet digital PCR system for absolute quantitation of DNA copy number;
发表期刊:Anal Chem. 2011; 83(22), pp 8604-8610
作者:Benjamin J. Hindson, Kevin D. Ness, Donald A. Masquelier, Phillip Belgrader, Nicholas J. Heredia, Anthony J. Makarewicz, Isaac J. Bright, Michael Y. Lucero, Amy L. Hiddessen, Tina C. Legler,Tyler K. Kitano, Michael R. Hodel, Jonathan F. Petersen, Paul W. Wyatt, Erin R. Steenblock, Pallavi H. Shah, Luc J. Bousse, Camille B. Troup, Jeffrey C. Mellen, Dean K. Wittmann, Nicholas G. Erndt, Thomas H. Cauley, Ryan T. Koehler, Austin P. So, Simant Dube, Klint A. Rose, Luz Montesclaros, Shenglong Wang, David P. Stumbo, Shawn P. Hodges, Steven Romine, Fred P. Milanovich, Helen E. White, John F. Regan, George A. Karlin-Neumann, Christopher M. Hindson, Serge Saxonov, and Bill W. Colston;

入选理由:第一篇采用ddPCR技术对大样品条件下NGS数据进行验证的文章。截止目前为止, ddPCR与NGS、Array联用来进行CNV位点发现及确认越来越成为一种“标准化的流程”。

文章标题:Structural haplotypes and recent evolution of the human 17q21.31 Region;
发表期刊:Nat Genet. 2012; 44(8), pp 881-885
作者:Boettger LM, Handsaker RE, Zody MC, McCarroll SA.;

文章摘要:
哈佛医学院由Steven A McCarroll领导的实验室对人17号染色体的17q21.31区域进行了深入研究,因为该区域复杂的基因组结构变异与神经性疾病以及妇女的不孕不育有关。

首先他们采用NGS进行了全基因组测序,在上述区域内发现了很多包括CNV在内的基因组结构变异,他们将该区域分成了3个大的片段。这时他们需要一种成本可控,高通量且快速的实验方法来对NGS发现的CNV位点在大样本的情况下进行验证。在文献中,他们采用了ddPCR的方法来完成对大样本的测试,结果显示ddPCR的结果与NGS的数据高度吻合,相关性大于99%。

入选理由:ddPCR与其他技术的联合使用,在各种组学的水平上进行的个性化研究。首次将ddPCR技术应用于等位基因的不平衡表达分析,并验证了NGS的结论。

文章标题:Personal Omics Profiling Reveals Dynamic Molecular and Medical Phenotypes;
发表期刊:Cell. 2012;148(6), pp1293-1307
作者:Chen R, Mias GI, Li-Pook-Than J, Jiang L, Lam HY, Chen R, Miriami E, Karczewski KJ, Hariharan M, Dewey FE, Cheng Y, Clark MJ, Im H, Habegger L,Balasubramanian S, O'Huallachain M, Dudley JT, Hillenmeyer S, Haraksingh R, Sharon D, Euskirchen G, Lacroute P, Bettinger K, Boyle AP, Kasowski M,Grubert F, Seki S, Garcia M, Whirl-Carrillo M, Gallardo M, Blasco MA, Greenberg PL, Snyder P, Klein TE, Altman RB, Butte AJ, Ashley EA, Gerstein M, Nadeau KC, Tang H, Snyder M.;

入选理由:首次将ddPCR应用于基因表达过程中不同选择性剪切产物的研究,并与肿瘤发病的机理研究相结合。

文章标题:Simultaneous Quantification of Alternatively Spliced Transcripts in a Single droplet digital PCR Reaction.;
发表期刊:BioTechniques 56:319-325 No.6 2014
作者:Bing Sun, Lian Tao, and Yun-Ling Zheng

文章摘要:
选择性剪接(alternative splicing)越来越成为基因表达调控的研究热点,据估计人类70%编码蛋白的功能基因都存在选择性剪接的调控方式,并且也是导致肿瘤发生的原因之一。二代测序(NGS)技术能很好的用来研究、分析特定基因不同的选择性剪接产物,但所需实验成本较高,且需要较大量的RNA样品。

目前为止,总共约有20种不同的人端粒酶逆转录酶(human telomere reverse transcriptase ,hTERT)的选择性剪接产物被报导,其中主要的4种产物在多种肿瘤组织中都存在(α deletion: α-/β+; β deletion: α+/β-; α + β double deletion: α-/β-; no-deletion: α+/β+)。仅全长的转录产物才具有相关的端粒酶活性,超过90%的肿瘤组织的端粒酶活性相比于癌旁组织有显著的升高,因此这些不同的选择性剪接产物可以被用来进行癌症机理的研究以及早期检测等的分子标记物。

长期以来研究人员缺乏足够灵敏和准确的技术来同时定量多种选择性剪接的RNA转录子,本文采用了微滴式数字PCR对hTERT 4种不同的剪接产物进行绝对定量的研究,也是进行选择性剪接此类研究的第一篇正式文献。只需要一对引物,两条TaqMan探针,无需标准品,就能在一个反应孔内,同时定量检测四种hTERT选择性剪接RNA转录子。

入选理由:首次以血浆游离DNA作为样品,采用ddPCR技术对非小细胞肺癌病人TKI治疗过程中的耐药性突变位点进行检测,证实了这种方法的可行性。

文章标题:Noninvasive Detection of Response and Resistance in EGFR-Mutant Lung Cancer Using Quantitative Next-Generation Genotyping of Cell-Free Plasma DNA.;
发表期刊:Clin Cancer Res 2014;20:1698-1705;
作者:Geoffrey R. Oxnard, Cloud P. Paweletz, Yanan Kuang, et al.;

文章摘要:
TKI靶向治疗肺癌是个性化治疗的范例之一,随着个性化治疗的深入,如何改变临床实践来确保最大程度发挥靶向治疗的作用非常重要。这样才能使可能获益的患者应用具有针对性的靶向药物,同时使不适宜靶向药物治疗的病人远离那些药物。

发表于Clinical Cancer Research上的该文章采用微滴式PCR的方法对晚期肺癌、黑色素细胞瘤病人的血浆游离肿瘤DNA进行EGFR、KRAS和BRAF的检测,希望能找到一种特异性好、灵敏度高的方法对病人肿瘤的基因型进行分析,试图克服目前常规检测方法繁琐、假阳性率高的问题。由于采用病人的血浆样品,因此这种方法对病人而言是非侵入性的,更重要的能够对肺癌病人在接受Erlotinib治疗后对疗效进行评估,并对可能产生的耐药突变进行监测,如T790M。

文章对9个接受厄洛替尼一线治疗的病人进行血浆游离肿瘤DNA的监测后发现:在其中6个病人的血浆中都能检测到耐药的T790M突变及其随治疗周期延长而导致的浓度增加;此外发现T790M突变在时间上比通过X光拍片确认发生肿瘤恶化最早可以提前16周。

可见微滴式数字PCR对于血浆游离肿瘤DNA的检测对于一线治疗疗效评估、耐药突变的检测以及个性化治疗在临床上的应用意义重大。


入选理由:首次将多对TaqMan探针的assay和ddPCR结合使用,实现了对肿瘤浸润性T淋巴细胞的分类。方法学上也证实了ddPCR与多重PCR结合使用的可行性。

文章标题:Digital Genomic Quantification of Tumor-Infiltrating Lymphocytes.;
发表期刊:Sci Transl Med 5, 214ra169 (2013)
作者:Harlan S. Robins, Nolan G. Ericson, Jamie Guenthoer, Kathy C. O’Briant, Muneesh Tewari, Charles W. Drescher, Jason H. Bielas;

文章摘要:
来自Fred Hutchinson癌症研究中心的研究人员利用ddPCR技术,首次对一种特殊的肿瘤攻击性免疫细胞进行了定量。

肿瘤浸润性T淋巴细胞(Infiltrating T lymphocyte),常常发现于恶性肿瘤中,并参与了宿主的免疫应答。多个独立的研究已经证明了肿瘤浸润性淋巴细胞(tumor-infiltrating lymphocytes, TILs)的存在及其数量与生存率密切相关。但是由于方法学的限制,当前对TILs的检测最多只能进行半定量。因此,不能利用TILs来进行临床决策。

鉴于TILs的重要性,特别是考虑到其对癌症预测的潜在效用以及它们在免疫应答中的作用,Fred Hutchinson癌症研究中心的研究人员利用QX100系统开发了一种基于微滴式数字PCR的“QuanTILfy”检测。由于适应性免疫细胞具有分子标签,而且T细胞在其T细胞受体(T cell receptor, TCR)基因位点进行基因重排,这使得对TILs的定量成为可能。“QuanTILfy”检测可对组织中(包括肿瘤)的TILs进行定量,并对T细胞的克隆性进行评估。而且,研究人员还开发了一种分型系统来对“克隆性”进行分级,“克隆性”或许是药物靶点的一个标记物。

在本研究中,Fred Hutchinson研究人员对30名卵巢癌患者的原发性肿瘤进行了QuanTILfy测定,这些患者已知生存预后在1-122个月之间。相比于生存期不到2年的患者,生存期超过5年的患者TILs出现率大约高3倍。这些结果表明,高水平TILs与患者生存呈正相关,支持了这一假说:TILs发挥了抑制肿瘤形成的作用。

QuanTILfy检测被证实精确性和灵敏度极佳。在血液和正常人肺成纤维细胞纯化出的人类T细胞的混合物中,这一检测能够在10,000个肿瘤细胞中检测到一次TCR重排。重要的是,它也证实了ddPCR技术能够通过多重检测在一次反应中同时定量大量的标记物。

在对该项目的领导Jason Bielas(Fred Hutchinson癌症研究中心公共健康科学部准会员)进行采访时,Bielas表示“现在我们具备了在肿瘤细胞中实现重现性计数TILs的能力,我们或许能够基于肿瘤TILs计数将患者进行分级,尤其是采用免疫疗法给予更有效的治疗。”

入选理由:首次在ddPCR上采用EvaGreen染料法实现了单孔、单通道情况下CNV和SNP的同时分析。

文章标题:High Sensitivity Detection and Quantitation of DNA Copy Number and Single Nucleotide Variants with Single Color Droplet Digital PCR.;
发表期刊:Anal. Chem. 2014, 86, 2618−2624
作者:Laura Miotke, Billy T. Lau, Rowza T. Rumma, and Hanlee P. Ji;

文章摘要:
该文献是第一篇在伯乐公司升级后的QX200上采用EvaGreen方法由斯坦福大学的科学家完成的文献。文章采用EvaGreen的方法仅利用单孔、单荧光信号通道就实现了对肿瘤细胞系和肠癌病人的临床样品进行了CNV和SNP的检测,前者以FLT3基因为靶点,后者以BRAF V600E的靶点。

在实验设计时,对不同扩增产物的长度进行控制,就能利用PCR反应结束后终点荧光信号强度的不同在一个反应孔内区分2种不同的产物。在FLT3 CNV的检测中,可以区分FLT3目标基因与UC1内参基因;在BRAF V600E的突变检测中,可以有效区分野生型与突变型对应的扩增产物。其检测结果与采用TaqMan探针法的结果完全一致。与传统的TaqMan探针相比,EvaGreen染料法在实验的设计、优化以及成本的控制方面更具有推广性。

入选理由:首次将ddPCR和qPCR在miRNA表达含量分析时结果的重复性进行了系统的统计学比较,证实了ddPCR方法的优势。具有较高的引用率。

文章标题:Absolute Quantification by droplet digital PCR versus Analog real-time PCR.;
发表期刊:Nature Methods | ADVANCE ONLINE PUBLICATION doi:10.1038/nmeth.2633
作者:Christopher M Hindson, John R Chevillet, Hilary A Briggs, Emily N Gallichotte, Ingrid K Ruf, Benjamin J Hindson, Robert L Vessella & Muneesh Tewari;

文章摘要:
来自Fred Hutchinson癌症研究中心等处的研究人员在《Nature Methods》发表文章证明了微滴式数字PCR(Droplet Digital PCR,ddPCR)技术能用于不同情况下,准确,可重复性的血浆和血清microRNA(miRNA)量化检测,这将为miRNA及其它核酸用于循环生物标志物的检测铺垫了道路。

文章的第一作者,Fred Hutchinson癌症研究中心人类生物学部Muneesh Tewari博士表示,“在循环系统miRNA诊断领域,微滴式数字PCR(ddPCR)能帮助我们进行生物标记物研究,直接比较同一实验室跨天多次试验,甚至不同实验室之间的检测结果。”

实时定量PCR(qPCR)已被广泛用于血液样品miRNA的分析测试中。但是研究人员发现,血清或血浆中的miRNA qPCR测量出现了极高的差异性,无法用作稳定的血液生物标志物的检测标准,因此这一领域的研究人员一直在寻求一种能获得更可靠结果的新方法。

数字PCR具有许多优于定量PCR的优点,比如无需标准曲线,以及不受不同样品和试验过程中PCR扩增效率变化的影响,就能获得绝对定量。而这些优点都体现在了Bio-Rad公司推出的这款 QX100™ Droplet Digital PCR (ddPCR™) 系统中。

为了评估每个工作流程的步骤,包括连续稀释准备,反转录(RT)和PCR扩增,Tewari博士和他的团队分别在三个独立的工作日中,通过ddPCR嵌套分析对比定量PCR,对水和血浆中6种不同的合成miRNA各稀释系列的cDNA进行分析,结果发现比较于qPCR,ddPCR在PCR特异性变化方面,具有更高的精确度(48-72%的更少变异系数)。

接下来,研究小组进行血清miRNA的qPCR和ddPCR并列比较检测。他们收集了20例晚期前列腺癌患者,和20例年龄相匹配的男性对照血清样品,分析其中的miR-141丰度,miR-141是一种已被证明的晚期前列腺癌的生物标志物。 研究人员分别在不同的三天里准备了qPCR和ddPCR分析的不同稀释浓度,并进行了检测,结果发现ddPCR相比于qPCR,能提高7倍不同一天里实验室的重复率,这在对照研究中也得到了证实:ddPCR的结果更为可信(p=0.0036 vs. p=0.1199)。

Tewari博士说,“我们选择使用Bio-Rad公司的QX100微滴式数字PCR系统,因为它是目前市场上的第一个从成本和通量上考虑,适合于实验室日常研究的数字PCR系统。微滴式数字PCR将能帮助我们更加精确的追踪病人治疗期间不同时间段中的血清microRNA生物标志物浓度变化情况,这对于实时PCR来说,有时是不可能实现的。”

入选理由:首次通过实验证实了微滴式数字PCR系统对PCR抑制物不敏感,尤其适合对复杂来源的样品进行核酸分子的检测与分析,具有较高的引用率。

文章标题:Tolerance of Droplet-Digital PCR vs Real-Time Quantitative PCR to Inhibitory Substances.;
发表期刊:Clinical Chemistry 59:11 (2013)
作者:Tanis C. Dingle, Ruth Hall Sedlak, Linda Cook, Keith R. Jerome;

文章摘要:
华盛顿大学医学检验系和福瑞德•哈金森癌症研究中心系统比较了QX100微滴式数字PCR和传统定量PCR对SDS、EDTA、Heparin(肝素,血液抗凝剂)等常见PCR抑制物的耐受程度。通过计算和比较两种平台的抑制曲线和最大抑制浓度中值(IC50)表明,微滴式数字PCR对SDS、肝素的耐受度高于定量PCR方法。

入选理由:ddPCR作为一种高灵敏度检测手段的出现,必将对上游的核酸纯化产业带来压力。该文是ddPCR技术大规模应用后,第一篇致力于针对具体的应用改善核酸纯化方法的应用文章。

文章标题:Akonni TruTip and Qiagen Methods for Extraction of Fetal Circulating DNA - Evaluation by Real-Time and Digital PCR.;
发表期刊:PLOS ONE. August 2013 | Volume 8 | Issue 8 | e73068
作者:Rebecca C. Holmberg, Alissa Gindlesperger, Tinsley Stokes, David Lopez, Lynn Hyman, Michelle Freed, Phil Belgrader, Jeanne Harvey, Zheng Li;

文章摘要:
很多利用定量PCR方法进行低拷贝核酸检测的研究人员很关心的问题之一就是检测的灵敏度,也就是说能够在多少拷贝的水平实现DNA或RNA分子稳定的检出。其实灵敏度主要取决于2个主要的方面:样品中核酸提取的效率和具体检测体系的灵敏度,两者一起决定了具体目标序列的检测灵敏度。

随着超灵敏度的微滴式数字PCR技术的出现,使得核酸纯化成为低拷贝模板检测过程中的瓶颈与限制性实验步骤,对从样品中进行高效的核酸分子提取提出了更高的要求。由Akonni Biosystems和Novartis的科学家共同完成的这篇文章以无创产前诊断或筛查(NIPD或NIPT)的应用为例,比较了Akonni Biosystems的TruTip和QIAGEN的Circulating Nucleic Acids试剂盒对于cffDNA提取的效果。对得到的核酸提取物分别采用定量PCR和ddPCR进行了分析,得到的结果显示Akonni Biosystems对于片段化的胎儿游离DNA提取的得率比QIAGEN的试剂盒提高了约87%,且定量PCR的结果与ddPCR结果相关性良好。

对于核酸序列高效的提取,该文献中虽然以NIPD或NIPT的应用为例,但对于其他的应用也具有重要的意义,例如从血浆或血清样品中对肿瘤相关突变的早期检测等。

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