成功ChIP的三大秘诀

【字体: 时间:2014年02月24日 来源:生物通

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  在基因调控领域,可以说没有比表观遗传学更热的话题了。而染色质免疫沉淀ChIP是表观遗传学研究中最常用的技术。

生物通报道:在基因调控领域,可以说没有比表观遗传学更热的话题了。而染色质免疫沉淀ChIP是表观遗传学研究中最常用的技术。

ChIP通过针对染色质相关蛋白(组蛋白、转录因子等)的抗体,来鉴定与该蛋白(或蛋白修饰)相连的序列。这种方式能够帮助人们定位基因组中发生的表观遗传学改变。举例来说,针对H3K4me3(赖氨酸-4上的组蛋白H3三甲基化)的抗体可用来检测活跃表达的基因,而针对H3K27me3的抗体可用于检测沉默的基因。

类似的技术还包括RIPRNA免疫沉淀)和MeDIP(甲基化DNA免疫沉淀)。RIP可以帮助人们鉴定,与特定RNA结合蛋白相连的RNA。而MeDIP技术允许研究者pull down甲基化的染色质序列。

这些方法的原理都很简单,但实际操作却并不容易。“ChIP的过程往往相当复杂,而且可能十分冗长,”Thermo Fisher公司的蛋白生物学研发经理Barbara Kaboord说。

一、提高染色质的质量

与绝大多数实验方法相同,核酸IP也遵循着GIGO原则(Garbage in, garbage out)。如果你的染色质原材料不佳,当然也就很难得到理想的实验结果。

“获得染色质很简单。不过要获得适用于ChIP的染色质就是另一回事了,”EMD Millipore公司的表观遗传学研发带头人John Rosenfeld说。

人们一般通过超声将染色质打成几百bp长的片段,但超声很难控制。超声时间过长或力度过强都会令蛋白变性,使其与核酸分离或者破坏抗体识别的抗原表位。这种方案需要进行大量的优化,但过多的参数往往令人难以下手。

除超声之外,也可以利用酶进行片段化。这种方案不仅更加简单温和,可重现性也更佳,Cell Signaling TechnologiesCST)公司负责ChIP产品研发的Chris Fry说。

CSTSimpleChIP®SimpleChIP Plus Enzymatic Chromatin IP试剂盒使用微球菌核酸酶,据称这种试剂盒能让用户简单控制所得片段的大小。“我们将试剂盒用于二十多种不同的细胞系和组织,都得到了同样长度的片段,”Fry说,只要用户保证酶与细胞数的比例不变。

ThermoPierce Magnetic ChIP试剂盒也使用微球菌核酸酶,不过该产品还包括一个可选的超声步骤,公司的蛋白生物学研发经理Barbara Kaboord说。在这种情况下,超声更多的是用来增加敏感性而不是进行片段化,它有助于从细胞核释放更多的染色质,Kaboord解释道。他指出,新用户可能会更适应单纯的酶学操作,因为那样更为简单直接。

酶学片段化方案也存在着一定的弊端,Life Technologies的科学家Loni Pickle说。因为核酸酶有时会表现出序列偏好,从而影响结果的真实性。另外,酶学消化也并不总能与甲醛交联(ChIP的一个关键步骤)兼容。最后,她指出“对片段大小进行优化也稍显困难。”

Pickle还强调,鉴于目前广为接受的是超声法,使用酶学消化的研究者们需要做更多的工作,来保证酶学消化对结果没有影响,。”

对于那些选择超声法的研究者们,Rosenfeld指出了四个需要考虑的关键参数:细胞密度、超声力度、超声时间和循环数。“但不要同时对几个参数进行优化,”他提醒道。


二、保证抗体的质量

用来进行pull-down的抗体,是成功核酸IP的另一个关键因素。Rockland Immunochemicals公司的研发主管Karin Abarca Heidemann介绍道,与Western blot相比核酸IP对抗体的要求更多。举例来说,Western blot抗体识别的是变性蛋白。但“在ChIP应用中,你需要确保抗体识别蛋白的三级结构或者一个暴露的抗原表位。”

最好的办法是选择一款经ChIP(或RIPMeDIP)验证的抗体。例如,Rockland公司提供的表观遗传学产品Epi-Plus™就是一系列已验证的抗体。据Abarca Heidemann介绍,Epi-Plus系列抗体在多种实验中进行过验证,包括Western blot、免疫组化、免疫荧光、免疫沉淀和ChIP,每个抗体的验证时间长达三到四个月。

Fry介绍,CST也对抗体进行了大量的验证工作,考虑了可能影响蛋白表达、定位或修饰的许多因素,包括高/低表达的细胞、RNA干扰、表达载体等等。该公司甚至使用多肽芯片来评估组蛋白修饰抗体的特异性。“我们不应满足于Western blot的结果,”他说。“抗体在越多实验中表现出特异性,就越能靶标到正确的靶点。”

“确保获得高质量的抗体,可能是ChIP实验中的最大难点”EMD Millipore公司的Rosenfeld说。该公司不仅有经ChIP验证的抗体(ChIPAb+™),还提供用于RIPRIPAb+™

靶标5-甲基胞嘧啶(5-mC)或5-羟甲基胞嘧啶的抗体,可以用来富集甲基化DNA。(例如,Active Motif公司提供的MeDIPhMeDIP试剂盒。)除此之外,你也可以通过甲基结合蛋白(MBP)来进行富集,这样的技术常被称为MIRAMethylated CpG Island Recovery Assay)。Active Motif公司的MethylCollector™ Ultra试剂盒就是利用这些蛋白来富集甲基化序列。

Active Motif公司的产品经理Kyle Hondorp介绍,抗体和MBP之间的主要差异在于,5-mC抗体识别单链DNA中的甲基化标签,而MBP与双链分子相互作用。

研究RNA-蛋白互作也有许多可供选择的工具。传统RIP从本质上来说就是不含交联步骤的ChIP,包括EMD Millipore在内的许多公司都提供相应的抗体和试剂盒产品。另外,iCLIP技术可以帮助人们定位RNA序列之间的相互作用。

Active Motif公司的RNA ChIP-IT®试剂盒,专用于研究RNA与细胞核染色质的相互作用。据Rosenfeld 介绍,EMD Millipore公司也即将推出两个类似的试剂盒,其中一个包含交联步骤以鉴定较短暂的相互作用。

如果你对某种RNA感兴趣,希望寻找与其发生相互作用的蛋白,那么ChIRPCHARTRAP都能满足你的需要。这些技术对目标RNA的互补寡核苷酸进行生物素标记,并由此捕获与目标RNA关联的蛋白。PierceMagnetic RNA-Protein Pull-Down试剂盒,允许用户给磁珠附上特定RNA作为诱饵,捕获与其发生互作的蛋白。这些蛋白之后可以通过Western blot和质谱分析进行鉴定。


三、控制细胞数

ChIP一般使用体外培养的细胞,每次反应所需的细胞量在一百万到一千万之间。现在,人们常常需要研究更为特殊的样本,例如肿瘤、组织活检样本、干细胞、已存档的FFPE样本(甲醛固定石蜡包埋)、流式细胞分选或激光捕获显微切割所富集的细胞。在这些情况下获得一百万细胞并不容易。

实验所需的细胞量取决于研究的对象,Kaboord说。组蛋白修饰比较丰富,需要的样本量也就相对较少。而转录因子丰度较低,一般需要大约一百万细胞,不过“如果信噪比高,那么样本量也可以适当减少。”

Rosenfeld解释道,ChIP过程中的高背景,决定了细胞数量的高要求。不过,供应商们也在不断优化着自己的试剂盒,以便处理更小的样品量,并获得更好的结果。他们采取的策略大多是优化缓冲液,或者用磁珠取代多孔的琼脂糖。

EMD MilliporeMagna ChIP™ HiSens高灵敏度试剂盒,减少了缓冲液中的去污剂成分,采用了防止粘附的硅化试管,并且在洗脱步骤之前整合了“tube switch step”。现在,该试剂盒研究转录因子只需要十万细胞,研究组蛋白修饰只需要一万细胞。

酶学片段化比超声法所需的细胞更少,Fry说,这是因为酶学方法更为温和。据介绍,CST公司的SimpleChIP Plus Enzymatic Chromatin IP试剂盒需要四百万细胞,用一个15cm培养皿上的粘附细胞足以进行三次IP。“对于组蛋白而言,细胞量少十倍仍可以得到很好的信号。”

现在,ChIP方案变得越来越简单,实验通量也越来越高。据Pickle介绍,以往一次ChIP实验可能需要数天。而Life TechnologiesMAGnify™ ChIP试剂盒只需要五个小时,而且能够进行扩展以适应大量的样本。

尽管不断被优化,大多数ChIP产品的基础方案并没有出现大的改变,一般还是用磁珠捕获抗体-磁珠复合体。不过,已经有一家公司开发出了另一种方案。

Porvair Sciences公司的Chromatrap®采用蛋白A/G偶联的BioVyon过滤装置,对抗体复合物进行捕获,整个过程无需磁珠。据该公司CEO Ben Stocks介绍,这个产品需要的起始样本更少,从开始到结束只需要五个小时,不仅产量提高25倍还可以兼容自动化工作流程。目前,该产品有spin column柱和微孔板两种形式。

Jeffrey M. Perkel撰写/叶予编译)

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