影响基因表达的因素有哪些？

做细胞转染的研究者经常会问：“为什么相同的基因我用不同的质粒构建时候不能得到相同的基因表达水平呢？”影响基因表达的因素有很多，例如质粒长度、报告基因选择的种类等。本文将为您揭示10种影响基因表达的因素。

选择一种恰当的质粒是影响基因表达的关键因素。请看Figure1.我们尝试利用10种不同的质粒构建成的融合质粒表达相同的虫荧光素酶报告基因，这10种融合质粒表达出的虫荧光素酶基因的表达水平各异。本文将告诉您影响基因表达的质粒因素。

Figure1.虫荧光素酶报告基因表达水平依赖于空载质粒的类型。以上是虫荧光素酶报告基因在THP1和HUVEC细胞中在4小时、24小时和48小时中的表达水平。在THP1细胞中，质粒DNA的量为0.3-0.5μg。HUVEC细胞中质粒DNA的量为2.5-4.4μg。

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1. 启动子强度
启动子的类型是否适用于现在的细胞类型？Table1展示了在不同的细胞类型中启动子的强度时不同的。尽管CMV在大多数哺乳动物细胞中属于较强的启动子，但是另外的启动子可能会在我们研究的这种细胞中有较强的表达(例如BHK-21细胞中SV40启动子)。

2. 内含子
许多研究者认为*理想的基因表达需要基本的内含子的剪切，然而这个观点并不是总被大家认可。内含子的位置和强度会影响转录、mRNA的输出和聚腺苷酸化。这样，依赖于内含子的位置，内含子甚至会导致基因表达的降解。

3. IRES(内部核糖体进入位点)
内核糖体剪切位点质粒，启动子驱动两种基因的表达，一个是感兴趣的克隆基因(经常是处在上游基因)，另一个是报告基因，通常编码GFP蛋白。IRES质粒表达的mRNA是双顺反子信使，意味着两个基因都在相同的mRNA分子上。两种基因的双顺反子数量是一样的，但是两种基因的翻译起始水平存在极大的不同。核糖体结合上游基因的起始位点是相当有效的，然而IRES却会让核糖体与下游基因的结合和翻译处于一个较低的水平。下游基因通常是GFP，因此GFP的表达水平就会低于没有IRES序列的质粒表达。而通常没有IRES序列的GFP质粒的表达水平我们认为是正常的。可以通过构建两种基因的融合质粒或者共转染实现表达相同数量的感兴趣的蛋白和GFP蛋白。

Figure2A显示了报告基因GFP处于IRES的上下游的不同位置，Figure2B显示了当GFP位于IRES的下游时，GFP的表达显著的下降。这项研究适用于GFP报告基因，同样也适用于虫荧光素酶报告基因。

Figure2.报告基因的表达水平依赖于在IRES表达载体上的位置。

你的质粒包含IRES序列吗？如果包含的话，它是位于质粒的什么位置呢？插入的两种基因的任何一种有可能会影响mRNA双顺反子的稳定性。两种基因的蛋白表达水平不是完全一样的。因此，由于报告基因低的表达水平，可能会造成对质粒表达真实效率的低估。对于报告基因在IRES下游的报告基因的检测，一定要用非常灵敏的检测方法。

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4. LTR(病毒长的末端重复)
许多质粒的表达利用逆转录病毒的LTR的启动子和增强子，然而当这些质粒被转染进入特定类型的细胞中时，可能会受到这些细胞对于其表达的抑制。尽管这种抑制机制未完全阐明，很有可能是因为来自于逆转录病毒的启动子或者增强子在某些原代细胞或者细胞系中不能很好的工作。**的解决办法就是利用传统的启动子例如CMV(e.g.,pmaxCloning Vector),EF1a或者SV-40将基因重新克隆至新的载体上。

5. 质粒的大小
在实验室中我们通常会使用4-7kb的质粒，而Lonza的Nucleofection可以转染长至20kb的质粒。若是更长的质粒可能会导致转染效率的降低。通常的规则是，质粒长度越长，越难进入到细胞内。这个规则适用于电穿孔的方法以及脂质体介导的方法。

6. 报告基因
用什么报告基因呢？报告基因需要满足几个要求：安全、重复性好、能定量、灵敏度好等。细胞内源性的该种基因表达水平不能太高，下游检测时需简单方便。当更换一种报告基因或者转染方法时，必须用目前使用的这种转染方法对报告基因的表达水平做动力学的评估以确定*佳的检测时间点。例如虫荧光素酶报告基因，当使用Nucleofection或者脂质体转染两种不同的转染方法时，其表达的动力学是不一样的（Nucleofection方法是在转染后6-16小时达到*高点，脂质体的方法是在24小时后达到*高点）。研究发现，虫荧光素酶报告基因的表达动力学与转染方法有关，与质粒载体和细胞类型无关。报告基因的表达水平还依赖于mRNA和蛋白的稳定性，我们用Nucleofection转染后比较了虫荧光素酶和β-gal的表达水平(Figure3)。对HUVEC细胞共转染虫荧光素酶报告基因和β-gal。这两种报告基因的动力学表现出明显的不同。虫荧光素酶报告基因的表达在转染后16小时后的表达就开始明显下降；然而，β-gal的表达在转染后10小时达到*高然后维持表达。若选择一个*佳的检测时间点的话，如果是24小时，那就已经错过了虫荧光素酶报告基因的*佳检测时间，也不足以代表真实的基因表达水平。因此，虫荧光素酶报告基因的推荐的*佳检测时间应该是转染后6-16小时，而β-gal或GFP的*佳检测时间是转染后10-48小时。

 

Figure3. 虫荧光素酶和β-gal报告基因转染后表达动力学的不同。虫荧光素酶报告基因在转染后6-16小时表达达*高点，而β-gal的表达在转染后可维持数天。

7. 检测方法
报告基因的检测方法有很多种。例如GFP下游的检测方法有荧光显微镜、流式细胞仪、荧光读板仪。如果只是想得到一张图像的话，可用荧光显微镜，若想得到定量结果，则可以用流式细胞仪或荧光读板仪的方法进行准确定量。

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8. 融合质粒VS.共转染
融合蛋白的表达水平依赖于转录、翻译、以及融合蛋白的折叠和稳定性。为改善蛋白的表达水平，建议更换蛋白融合的末端序列。除融合质粒外，也可采用共转染的方法。一种质粒表达报告基因，另外一种质粒表达感兴趣的基因。由于启动子强度和质粒大小的不同，两种质粒的比例需要进行优化。

9. 基因产物的发夹结构
RNA形成的发夹结构会影响基因的翻译水平。这个因素需要考虑，例如，向表达的基因中引入突变序列的时候。

10. Kozak序列
Kozak序列会改善核糖体识别ATG起始密码子的几率。如果Kozak序列与ATG起始密码子相邻的话，会极大地增强感兴趣基因的翻译和蛋白表达水平。

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