明星技术CRISPR新手操作指南

 生物通报道：十年前，当研究人员开始解析细菌和古细菌中一个称为CRISPR结构的时候，他们并没有预料到这会给基因编辑世界带来一场风暴。在过去的这一年半时间里，CRISPR方法已迅速席卷了整个动物王国，成为DNA突变和编辑的一种“马上”技术——迄今为止在几乎每种实验细胞类型中都能起作用，包括人类细胞，小鼠，斑马鱼和果蝇细胞；这种技术也易于操作，已经有两个研究组利用CRISPR分析了人类细胞中几乎每个基因单突变(Science, 343:80-84, 2014; Science, 343:84-87, 2014)。就在最近，CRISPR还帮助研究人员完成了携带特殊基因中断（gene disruptions）的工程猴，这项壮举此前曾在小鼠中实现过，但未在灵长类动物中完成过(Cell, doi:10.1016/j.cell.2014.01.027, 2014)。

 

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CRISPR本身是一种防御系统，用以保护细菌和古细菌细胞不受病毒的侵害。在这些生物基因组中的CRISPR位点能表达与入侵病毒基因组序列相匹配的小分子RNA 。当微生物感染了这些病毒中的一种，CRISPR RNA就能通过互补序列结合病毒基因组，并表达CRISPR相关酶，也就是Cas，这些酶都是核酸酶，能切割病毒DNA ，阻止病毒完成其功能。

 

将CRISPR/ Cas系统用于其它非细菌细胞需要满足两个条件：一个Cas酶，用于切断靶标DNA，比如目的基因中的DNA片段，另外一个就是称为导向RNA（gRNA）的RNA分子，这种分子能通过互补结合靶标。不过CRISPR技术也存在一个主要的缺点，那就是缺乏特异性。

 

近期The Scientist杂志汇总了基因编辑过程中Cas和gRNA的处理过程及解决方案，用于帮助新接触这一技术的研究人员熟悉这项热门技术。

 

第一步：如何CRISPR我的靶标？

由于CRISPR系统并不复杂，因此我们所要做的就是将带有质粒（能表达Cas和gRNA）的细胞进行转染。

 

研究人员可以采用一种Cas的变体，即Cas9，这种酶来自于一种链球菌，由RNA进行指引，能无需其他蛋白的帮助而切割DNA（Science, 337:816-21, 2012）。Cas9既能切断与gRNA结合的DNA链，也能切断其互补链。目前可以从Addgene购买Cas9质粒（美国本地价格为65美元），将其直接转染入细胞。

 

gRNA的长度约为80个核苷酸，包含两个区域：gRNA5'端前20个核苷酸对应于靶标DNA，能结合在靶标DNA上，剩余的约60个核苷酸（gRNA长度取决于表达gRNA的质粒）形成一个发夹结构，这个结构能帮助gRNA与Cas9结合，并由此指导与DNA的结合。

 

gRNA与Cas9一样，也是通过质粒表达的，从Addgene可以购买几种这种质粒（美国当地价格为65美元），但是与Cas9不同的是，我们需要自己定制与靶标相匹配的表达质粒。我们可以设计一个编码20个碱基，与靶标DNA结合的片段，将其克隆进表达质粒里（编码gRNA其它部分的60个核苷酸已经在质粒中了）。唯一的设计要求就是，gRNA上要有一个片段，能与由任意核苷酸序列（N）+5'末端两个胞嘧啶核苷酸（-NCC）的DNA结合。这是因为gRNAs似乎与相对链包含两个鸟嘌呤残基（-NGG）的DNA片段结合最好，这种-NGG序列也就是PAM结构（protospacer adjacent motif）。

 

未完待续……

（生物通：张迪）