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明星技术CRISPR新手操作指南

【字体: www.ebiotrade.com 时间:2014年3月13日 来源:生物通

摘要:

  十年前,当研究人员开始解析细菌和古细菌中一个称为CRISPR结构的时候,他们并没有预料到这会给基因编辑世界带来一场风暴……

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 生物通报道:十年前,当研究人员开始解析细菌和古细菌中一个称为CRISPR结构的时候,他们并没有预料到这会给基因编辑世界带来一场风暴。在过去的这一年半时间里,CRISPR方法已迅速席卷了整个动物王国,成为DNA突变和编辑的一种“马上”技术——迄今为止在几乎每种实验细胞类型中都能起作用,包括人类细胞,小鼠,斑马鱼和果蝇细胞;这种技术也易于操作,已经有两个研究组利用CRISPR分析了人类细胞中几乎每个基因单突变(Science, 343:80-84, 2014; Science, 343:84-87, 2014)。就在最近,CRISPR还帮助研究人员完成了携带特殊基因中断(gene disruptions)的工程猴,这项壮举此前曾在小鼠中实现过,但未在灵长类动物中完成过(Cell, doi:10.1016/j.cell.2014.01.027, 2014)

 

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CRISPR本身是一种防御系统,用以保护细菌和古细菌细胞不受病毒的侵害。在这些生物基因组中的CRISPR位点能表达与入侵病毒基因组序列相匹配的小分子RNA 。当微生物感染了这些病毒中的一种,CRISPR RNA就能通过互补序列结合病毒基因组,并表达CRISPR相关酶,也就是Cas,这些酶都是核酸酶,能切割病毒DNA ,阻止病毒完成其功能。

 

CRISPR/ Cas系统用于其它非细菌细胞需要满足两个条件:一个Cas酶,用于切断靶标DNA,比如目的基因中的DNA片段,另外一个就是称为导向RNAgRNA)的RNA分子,这种分子能通过互补结合靶标。不过CRISPR技术也存在一个主要的缺点,那就是缺乏特异性。

 

近期The Scientist杂志汇总了基因编辑过程中CasgRNA的处理过程及解决方案,用于帮助新接触这一技术的研究人员熟悉这项热门技术。

 

第一步:如何CRISPR我的靶标?

由于CRISPR系统并不复杂,因此我们所要做的就是将带有质粒(能表达CasgRNA)的细胞进行转染。

 

研究人员可以采用一种Cas的变体,即Cas9,这种酶来自于一种链球菌,由RNA进行指引,能无需其他蛋白的帮助而切割DNAScience, 337:816-21, 2012)。Cas9既能切断与gRNA结合的DNA链,也能切断其互补链。目前可以从Addgene购买Cas9质粒(美国本地价格为65美元),将其直接转染入细胞。

 

gRNA的长度约为80个核苷酸,包含两个区域:gRNA5'端前20个核苷酸对应于靶标DNA,能结合在靶标DNA上,剩余的约60个核苷酸(gRNA长度取决于表达gRNA的质粒)形成一个发夹结构,这个结构能帮助gRNACas9结合,并由此指导与DNA的结合。

 

gRNACas9一样,也是通过质粒表达的,从Addgene可以购买几种这种质粒(美国当地价格为65美元),但是与Cas9不同的是,我们需要自己定制与靶标相匹配的表达质粒。我们可以设计一个编码20个碱基,与靶标DNA结合的片段,将其克隆进表达质粒里(编码gRNA其它部分的60个核苷酸已经在质粒中了)。唯一的设计要求就是,gRNA上要有一个片段,能与由任意核苷酸序列(N+5'末端两个胞嘧啶核苷酸(-NCC)的DNA结合。这是因为gRNAs似乎与相对链包含两个鸟嘌呤残基(-NGG)的DNA片段结合最好,这种-NGG序列也就是PAM结构(protospacer adjacent motif)。

 

未完待续……

生物通:张迪)

(http://www.ebiotrade.com/)
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