基于纳米孔的单分子蛋白检测技术

　　

生物通报道 就在全世界对Oxford Nanopore的迷你MinION测序仪翘首盼望之时，该公司的创始人Hagan Bayley又宣布了纳米孔（nanopore）技术的蛋白质组应用。这项成果发表在《Nature Biotechnology》杂志上。

Hagan Bayley是牛津大学化学系的教授，也是Oxford Nanopore公司的创始人和股东。他领导的研究小组此次证实，纳米孔能够区分硫氧还蛋白的不同磷酸化亚型。Bayley认为，尽管距离蛋白质测序还很远，但这项成果也代表了向单分子蛋白分析迈进了一步。

在这项研究中，Bayley的研究小组将单个α-溶血素蛋白孔插入两侧带有电极的膜中。在此设置中，唯一的电路是通过纳米孔，其中系统记录电流。为了评估系统对磷酸化的灵敏度，研究小组使用了硫氧还蛋白的几个突变体，它们在C端附近都有单个磷酸化位点，并带有30聚DNA寡核苷酸的帽子。

施加电流后，DNA寡核苷酸被拖入纳米孔中，并牵引蛋白质，使其展开，就好像拉着一卷绳子一样。随着蛋白质穿过纳米孔，检测系统记录电流的变化。

结果表明，磷酸化蛋白对基线电流的干扰与非磷酸化蛋白略有不同。在一个实验中，研究人员使用了两个位置可磷酸化的蛋白，并对其部分磷酸化。当202个所产生的蛋白分子穿过纳米孔时，系统区分出4种可能的亚型。

其他方法也能区分蛋白亚型，但那些方法的对象是蛋白群体，而纳米孔读取单分子，Bayley认为这是个关键优势。“你正在分析单个分子。如果你花上几分钟的时间，你能查看几百个分子，并了解每一个的磷酸化状态。”

当然，这种方法还并非完美，仍存在问题。此研究中使用了磷酸化状态已知的纯化蛋白质。这些蛋白质并非穿过，而是开始进入纳米孔，停顿一会儿，然后突然出现在另一侧。因此，这种方法还不能区分氨基酸序列的中部存在差异的蛋白亚型。

Bayley表示，研究小组可能会使用抗体，让蛋白质在特定位置停留，从而解决这一问题。他也希望在天然蛋白质上应用这一方法，并检测其对于大分子的效果。

“这是第一篇这种类型的文章，而这样的论文通常都很原始和粗糙。我们希望在未来几年能大大改进这种方法，”Bayley谈道。（生物通 薄荷）

原文阅读

Single-molecule site-specific detection of protein phosphorylation with a nanopore

Christian B Rosen, David Rodriguez-Larrea & Hagan Bayley
Nature Biotechnology 32, 179–181 (2014) doi:10.1038/nbt.2799