Nature子刊：改造测序仪来研究RNA-蛋白互作

　　

尽管RNA与蛋白质的结合在许多生物学过程中非常重要，如剪接和许多转录后的过程，但目前还没有很多高通量的分析，能研究蛋白-RNA相互作用。《Nature Biotechnology》近日发表了一篇有趣的文章，将Illumina测序仪改造后用于RNA结合研究。

这项研究是由斯坦福大学医学院遗传学系的William Greenleaf领导的。研究小组改造了Illumina的Genome Analyzer IIx测序仪，让它能够定量测定蛋白质与流动槽表面超过1000万个RNA目标的结合，从而开展超高通量的RNA-蛋白互作研究。

在实验过程中，研究人员非常聪明地创建出转录的RNA片段，它们连着流动槽表面的DNA。这些DNA拴着的RNA分子随后被作为荧光标记RNA结合蛋白的底物。由于蛋白是荧光标记的，RNA结合事件就能够被测序仪定量测定。

（图片来自William Greenleaf实验室）

大致过程如下。研究小组设计出RNA目标序列，它们能够被Illumina流动槽中的大肠杆菌RNA聚合酶（RNAP）所转录。设计出的RNA目标序列包含RNAP起始和停止序列，以及编码MS2 RNA多个序列变体的区域。它们还带有条形码，以鉴定不同的RNA变体。

在测序目标序列之后，他们去除了测序的DNA链，生成了双链DNA，并在dsDNA的末端添加了生物素-链霉亲和素的路障。之后他们利用E.Coli RNAP生成了26个碱基的RNA。在通过洗涤步骤去除多余的RNA聚合酶之后，他们提供四种碱基，让RNAP转录可变区，并在生物素-链霉亲和素路障前停止。通过这种方式，研究人员能够创建出RNA芯片，其中包含1200万个不同的RNA群体。

之后，研究小组在流动槽上加入荧光标记的RNA结合蛋白（MS2外壳蛋白），让RNA结合蛋白与RNA结合。他们以10种不同的RNA结合蛋白浓度开展实验。最后，他们使用图像分析工具来分析荧光衰减，以测定结合和解离常数。

研究人员认为，大规模并行芯片上RNA的定量分析将有助于人们了解序列-功能关系的生物物理基础和进化后果。（生物通 薄荷）

原文检索

Quantitative analysis of RNA-protein interactions on a massively parallel array reveals biophysical and evolutionary landscapes

Nature Biotechnology (2014) doi:10.1038/nbt.2880