植物学家的春天：样品制备工具[选购宝典]

理论上，学植物是挺美的一件差事，整天对着花花草草，多惬意啊。关键是，还不用解剖小动物。想当年，我们的动物学实验课，那可是惨叫声一片啊。可实际上，植物学研究人员也并非那么轻松，面临着不少难题。

大家都知道，植物细胞与哺乳动物细胞不同，有着厚厚的细胞壁，也包含叶绿体这种额外的细胞器。然而，它们之间的差异还远远不止这些。对于动物细胞研究而言，很多方法是放之四海而皆准的，研究小鼠的方法也可以用于人类。但植物就并非如此。拟南芥的研究方法就未必适用于玉米，叶片的提取方法也不一定适合花瓣。这之间的差异，可能超乎你的想象。同时，植物学的研究工具远不如动物学丰富。翻开厚厚的产品目录，大部分产品都是适用于动物组织和细胞。好在，这种情况在不断改善，各大厂家也陆续推出植物研究工具。

作为植物研究中的基本环节，核酸和蛋白质提取面临两个主要的问题。首先，植物有细胞壁，比动物组织更难破碎。其次，植物细胞中往往含有抑制下游反应的组分，如单宁、酚类等。在研究过程中，我们要特别注意这两个问题。

蛋白提取

为了对付坚韧的细胞壁，研究人员通常将材料冷冻在液氮中，并将其研磨成粉末。他们可以采用研钵和研杵来手工研磨，也可以利用杜恩斯匀浆器来处理。MP Biomedicals的FastPrep®-24是市场上颇受欢迎的破碎仪。它采用一种专利的技术，能够对几乎任何样品进行非常高速的裂解。24个样品的处理仅需40秒钟。MP Bio近日还推出了新产品FastPrep-24™ 5G，是专为耐磨及难裂解的样品而开发的。欢迎申请试用>>

赛默飞世尔的P-PER（植物总蛋白提取试剂）则采用了一种不同的方法。你可将植物材料与提取试剂放在聚丙烯网袋内，这种网袋类似于那种保存食物的拉链密封袋。之后按照操作说明书，使用尖端圆滑的坚硬物体，例如有盖子的记号笔，从网袋外部研磨植物组织，确保P-PER工作液与组织充分混合，没有明显的完整组织残留。对于那些硬硬的种子，如大豆，也可以采用研杵来帮助破碎。

这个试剂盒采用一种有机裂解试剂和两种水相溶剂，再结合温和的机械搅拌，来高效地提取植物蛋白。仅需10分钟即可完成抽提，产量与传统方法相当，还不会听到刺耳的声音。据介绍，这种方法可以裂解来源于不同种属（拟南芥、烟草、玉蜀黍、大豆、豌豆、水稻、菠菜等）的多种植物组织（叶、茎、根、种子和花）。新鲜的、冷冻的和脱水的植物组织都行。当然，这不是一种高通量的方法，每一块组织都要单独处理。

核酸提取

对于植物中的核酸提取，CTAB法是一种最常用的方法。CTAB（十六烷基三甲基溴化铵）作为一种阳离子去污剂，可溶解细胞膜，与核酸形成复合物。它在高盐溶液中是可溶的，当盐浓度降低到一定程度时，复合物从溶液中沉淀。此时，通过离心可将CTAB-核酸复合物与蛋白质、多糖等分开，然后将复合物溶解于高盐溶液中，并通过乙醇沉淀分离核酸。

CTAB法虽然是经典方法，但针对不同的样品类型，可能还需要改良，而且要配制各种试剂，耗时耗力。实验达人也许乐此不疲，但新手就一筹莫展了。这时，采用商业化的试剂盒未必不是个好主意，况且市场上有那么多种产品。

核酸纯化的标杆QIAGEN就提供多种植物DNA提取试剂盒，包括DNeasy Plant Mini Kit和DNeasy Plant Maxi Kit（样品量不同）以及高通量的DNeasy 96 Plant Kit。与其他的DNeasy试剂盒一样，这一系列产品采用硅胶模技术和简单的离心操作从植物组织和细胞或真菌中提取高纯度的DNA。

操作流程如下：首先对样本进行机械搅拌，然后进行化学裂解。在裂解过程中，RNA被RNAase消化去除。细胞碎片、沉淀的蛋白质和多糖都被去除，并且样本通过QIAshredder离心柱并离心实现匀浆。调节缓冲溶液条件，并将裂解产物上样到DNeasy离心柱中。在短暂的离心过程中，DNA选择性结合到硅胶膜上，污染物通过。余下的污染物和酶抑制剂经过一到两步的洗涤步骤去除。然后，用水或者低盐缓冲溶液将纯化的DNA洗脱即可。

经过验证，这一系列试剂盒可用于拟南芥、向日葵、烟草、水稻、小麦、番茄等多种植物。Mini试剂盒的产量为3–30 µg，Maxi的产量为30–260 µg。这个产量差异主要与样本有关，取决于基因组大小、倍体、细胞数量和样本年龄。

对于RNA提取，QIAGEN也提供RNeasy Plant Mini Kit。这个试剂盒也采用QIAshredder离心柱来匀浆化和过滤高粘度的植物或真菌的裂解物，并利用硅胶模技术（RNeasy离心柱）来纯化多达100 µg的RNA。它能够处理10-100 mg的组织或100 – 1x10⁷个细胞。对于100 mg组织的产量，各个样本有不同，例如玉米叶仅为25 µg，而番茄叶高达65 µg。在QIAGEN的网站上列出了适用的样品类型，若你的研究对象不在其中，可致电技术支持。

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植物microRNA也是热门的研究对象。对于这小小的miRNA纯化，Life Technologies推荐使用mirVana miRNA Isolation Kit。此试剂盒最早由Ambion推出，经历了ABI时代、Life Tech时代，如今又迈入Thermo时代，可谓公司的四朝元老啊。同时，它也是文献中引用很多的一个产品。

此试剂盒采用改良的玻璃纤维滤膜方法来快速回收细胞或者组织样本中全部RNA，包括miRNA。首先用变性裂解液裂解样品，让RNase失活，使RNA稳定。裂解液随后用酸-酚：氯仿来萃取，去除大部分细胞成分，留下半纯的RNA样品。然后再通过玻璃纤维滤膜来进行纯化。你可以选择纯化总RNA，也可以只纯化小分子RNA。30分钟即可获得高纯度的RNA。

对付抑制剂

植物都包含不同程度的多糖和多酚，这些会使下游实验变得复杂。比如多酚会抑制酶切反应，而多糖会与DNA一起沉淀，变成一大团。此外，植物还含有色素和多种酶，有时也会影响下游的分析。对于这种种的挑战，我们看看研究人员想出了什么办法应对。

内布拉斯加大学林肯分校的助理教授Keenan Amundsen的研究对象是草坪用草，如野牛草。他使用液氮和珠磨式组织研磨器来实现细胞破碎，之后通过离心处理和苯酚/氯仿提取来分离核酸。

Amundsen通常采用CTAB法来提取DNA，氯化锂来提取RNA。有时为了应急，他也会使用QIAGEN的试剂盒。不过，他的经验是手提方法能得到更多的产物。在提取过程中，他会添加聚乙二醇（PEG）以去除多糖，添加PVPP（聚乙烯聚吡咯烷酮）以去除酚类。

Life Technologies也提供了一种商业化的产品Ambion® Plant RNA Isolation Aid，在预处理步骤中去除这些污染物。它采用PVP（聚乙烯吡咯烷酮）来结合多糖与多酚。专家建议，在使用玻璃纤维滤膜的方法从植物组织中纯化总RNA（如之前提到的mirVana）时，使用这种辅助试剂，因为操作流程中没有乙醇沉淀步骤。

当然，植物还含有色素和酶，别小看这些成分，它们有时会将纯化过程弄得一团糟。爱丁堡大学的Steven Spoel利用染色质免疫沉淀（ChIP）来研究拟南芥的转录调控。他的研究小组通常会忽略叶绿素，但有时却不得不去除。“我们也会做凝胶过滤或离子交换，但过滤柱在这之后就基本没用了，”他说。

同样地，我们大多会忽略RuBisCO酶。这种酶在光合作用中催化碳固定反应，是植物中最丰富的蛋白质。它占了绿叶中蛋白总量的40%，就像血清中的白蛋白一样，会遮盖掉一些低丰度的蛋白，从而干扰蛋白质组研究，比如LC-MS/MS和双向电泳。去除RuBisCO可是个挑战。市场上一些产品可解决这个问题。Sigma-Aldrich提供一种Anti-RuBisCO纯化柱，采用IgY抗体交联的磁珠来特异去除植物提取物中的RuBisCO蛋白。

植物学家的建议

正如我们之前提到的，由于植物和植物组织的多样性，没有一种实验方案是普遍适用的。但植物学家也提出了一些研究方面的建议，可能会对你有帮助。

首先，检索文献。即使你研究的物种是比较新的，但其他人也可能会提供相关物种的经验。植物学家还建议使用一些相对幼嫩的组织，如嫩叶。它们往往比那些坚硬的组织（如树皮或种子）更容易处理。

其次，使用商业化的试剂盒。价格当然是会贵一点，但也不至于太离谱。从说明书上的基本操作开始，然后慢慢优化。举个例子，如果你在破碎之后还看到完整的组织，那么你可能还需要用点力，或者调整起始材料的量。若你还有疑问，可以联系技术支持，他们通常会告诉你哪些物种适用，哪些不适用。

如今，有了这么多新的工具，植物学家应该可以松口气。随着国家对农业的重视，相信植物学研究的春天即将来临。（生物通 余亮）