倾听细胞的低语，胞外体研究指南（后篇）

人们往往以为，血液、尿液、乳汁和脑脊液这些体液系统是均匀的，不过事情并非这么简单。蛋白（和核酸）的确能够在这些体液系统中自由流动。但也有一些生物分子被包裹在脂质囊泡中，这些囊泡被称为胞外体。近年来研究者们渐渐发现，这些胞外体中含有大量可以成为生物学指标的分子。

生物通报道：人们往往以为，血液、尿液、乳汁和脑脊液这些体液系统是均匀的，不过事情并非这么简单。蛋白（和核酸）的确能够在这些体液系统中自由流动。但也有一些生物分子被包裹在脂质囊泡中，这些囊泡被称为胞外体（Exosome）。近年来研究者们渐渐发现，这些胞外体中含有大量可以成为生物学指标的分子。

胞外体中的生物学指标

虽然胞外体中的生物学指标在临床研究中颇具潜力（尤其是肿瘤研究），但目前这些生物学指标还没有真正用到临床上去，Hill说。不过，这一天已经不再遥远。

Exosome Diagnostics公司开发了一个三转录本panel，可通过尿液中的胞外体，预测患者是否患上侵袭性的前列腺癌。这一产品有助于减少不必要的组织活检。“这不是一个检测性的产品，而是一种排除法测试，” Exosome Diagnostics公司的首席科学家Johan Skog说。“该产品的阴性预测值高，能够很好的告诉你哪些患者不太可能患中/高级别的前列腺癌。”据介绍，Exosome Diagnostics公司将在今年发布这款名为EXO106的产品。

有些研究者关注的是胞外体内部的蛋白。比如George Mason大学应用蛋白组学和分子医学中心的Lance Liotta和Virginia Espina，他们从体外培养的视网膜色素上皮细胞分离胞外体，并通过反相蛋白芯片鉴定与黄斑变性发展有关的磷酸化蛋白。

据介绍，这项研究鉴定了数百个与潜在致病通路有关的蛋白，这些蛋白既可以成为治疗的靶标又可以作为诊断用的生物学指标。“我们计划在今年夏天，开展针对人类玻璃体样本的更大规模分析，”他说。“我们将收集生物学指标数据，并将其与视网膜病变情况关联起来。”

麻省总医院的Hakho Lee和Ralph Weissleder关心的是胞外体表面的蛋白。他们在2012年发现，针对胞外体上三种蛋白（胞外体特异性表面蛋白CD63，EGFR受体和肿瘤特异性突变蛋白EGFRvIII）的抗体，可以用来评估肿瘤负荷和多形性胶质母细胞瘤的治疗效果。这项研究使用一种“微型核磁共振”微流体系统，先用抗体标记胞外体进行筛选，然后用磁性纳米颗粒标记细胞进行NMR检测。

最近Lee和Weissleder又向人们展示，使用针对CD63、EpCAM和CD24的抗体，可以通过以微流体为基础的表面等离子体共振技术在血清中监控卵巢癌。

Lee认为，胞外体可以作为很好的非侵入性检测指标，帮助人们评估肿瘤负荷和治疗效果。“研究证实胞外体的确能够反映原发瘤的蛋白特征，我们可以利用这一点通过胞外体进行肿瘤诊断，无需组织活检。”

胞外体的研究工具

差速离心（differential ultracentrifugation）是分离胞外体的传统方法，也是Lee和Weissleder在研究中使用的方法。“实际上，这是一种金标方法，”Hill说。这一策略包括，先通过较低速的离心去除细胞残骸，然后逐渐提高转速直到100,000 x g，离心差不多一个半小时。这种方法制备的胞外体，可以进行功能分析或生物学指标的开发。

不过，超速离心速度较慢，也无法实现高通量。此外，超速离心中有许多变量需要标准化（例如转子的选择和离心条件等等），很难转化到临床中去，Skog说。为此，不少公司开发了一些替代性的产品。

Hill的实验室对一些替代性产品进行了测试。举例来说，Norgen Biotek公司有一款以spin-column柱为基础的胞外体RNA分离试剂盒，Hill的研究团队将这种试剂盒制备的RNA与超速离心得到的胞外体RNA进行了比较。他们发现，试剂盒在处理血浆时出现了一些明显的RNA污染，但处理血清就没有这样的问题。Exosome Diagnostics公司也提供有以spin-column柱为基础的RNA富集试剂盒。

Thermo Fisher的全胞外体分离试剂采用了一种专利的多聚物，这种多聚物能够沉淀胞外体，进而将其分离出来。另外，该公司的Dynabeads®与特定抗体连用（如CD63抗体），可以特异性的收集胞外体组分。（HansaBioMed公司的ExoTEST™试剂盒也可以达到同样的目的。）

现在，胞外体的研究工具正在日益增多，为研究者们提供了越来越便利的实验条件。随着以胞外体为基础的诊断技术进入临床，相信胞外体研究领域很快会迎来爆炸式的发展。

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参考文献：

[1] Biasutto, L., et al., “Retinal pigment epithelium (RPE) exosomes contain signaling phosphoproteins affected by oxidative stress,” Exp Cell Res, 319:2113–23, 2013. [PubMed ID: 23669273]

[2] Shao, H., et al., “Protein typing of circulating microvesicles allows real-time monitoring of glioblastoma therapy,” Nat Med, 18:1835–40, 2012. [PubMed ID: 23142818]

[3] Im, H., et al., “Label-free detection and molecular profiling of exosomes with a nano-plasmonic sensor,” Nat Biotechnol, published online April 20, 2014. [Nature Biotechnology]

[4] Cheng, L., et al., “Exosomes provide a protective and enriched source of miRNA for biomarker profiling compared to intracellular and cell-free blood,” J Extracell Vesicles, 3:23743, 2014. [PubMed ID: 24683445]

（Jeffrey M. Perkel撰写/叶予编译）