Nucleic Acids Research:提高基因组编辑效率的新方法

【字体: 时间:2014年05月20日 来源:生物通

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  ZFN、CRISPR/Cas9和TALEN都被证明是有效的基因组编辑工具。现在,科学家们利用简单的核酸适体(aptamer)进一步提高了这些工具的性能。

  

生物通报道:ZFNCRISPR/Cas9TALEN都被证明是有效的基因组编辑工具。现在,科学家们利用简单的核酸适体(aptamer)进一步提高了这些工具的性能。

锌指核酸酶ZFN,类转录激活因子效应物核酸酶(TALEN)和最近大热的CRISPR/Cas9系统,可以帮助研究者们进行位点特异性的基因组编辑。这些方法向基因组中引入位点特异性的双链断裂,然后利用寡核苷酸与目的位点的同源重组进行修复,从而实现对基因组特定位点的改变。目前,这类技术在基因分析中越来越重要,但同源重组的频率较低,阻碍了这些技术在许多细胞类型中的应用。

美国乔治亚理工学院的副教授Francesca Storici与同事开发了一种由核酸适体引导的新基因打靶方法(AGT),这种方法能够大大提高供体序列的同源重组率,文章发表在Nucleic Acids Research杂志上发。

“在减数分裂的过程中,两个同源染色体之间的DNA重组率很高,因为它们聚集在一起。而有丝分裂细胞中,两个姐妹染色单体的DNA重组也很有效,因为它们离得很近,” Storici解释道。“我们希望利用核酸适体,将供体序列带到目标序列附近的区域,在正确的位点促进重组事件的发生。”

为此,Storici的研究团队构建了一个双功能的DNA寡核苷酸,这种寡核苷酸由供体序列和一个核酸适体组成。核酸适体是指能够与目标分子(例如蛋白)高亲和力结合的短核酸序列。如果核酸适体能够结合基因组编辑位点附近的DNA结合蛋白,就可以将供体序列带到需要编辑的基因组区域。(延伸阅读:Nature子刊:黄行许教授解决基因组编辑的脱靶问题

研究人员将归位内切酶(Homing EndonucleaseI-SceI的识别位点插入到酵母的TRP5基因中,将这种酶的切割位点作为基因编辑的目标。然后,他们选用了能够结合I-SceI的核酸适体,构建包含野生型TRP5的供体序列。

研究显示,将这一序列转染到酵母细胞中以后,TRP5基因的矫正率比对照组提高了32倍。随后研究人员又在人类胚肾细胞中(HEK-293)进行了类似的实验,结果核酸适体将基因矫正率提高了16

下一步,Storici实验室的研究人员将会继续寻找亲和力更高的DNA适体,并探索用RNA替代DNA构建双功能寡核苷酸的可能。“此前的研究显示,RNA有修复DNA断裂和传递遗传信息到染色体DNA的能力,这意味着RNA肯定也可以作为一种供体分子,”Storici说。使用和调控RNA适体,可以进一步提高基因打靶的效率,拓宽这种方法的应用范围。

 

生物通编辑:叶予

生物通推荐原文摘要:

Aptamer-guided gene targeting in yeast and human cells

Gene targeting is a genetic technique to modify an endogenous DNA sequence in its genomic location via homologous recombination (HR) and is useful both for functional analysis and gene therapy applications. HR is inefficient in most organisms and cell types, including mammalian cells, often limiting the effectiveness of gene targeting. Therefore, increasing HR efficiency remains a major challenge to DNA editing. Here, we present a new concept for gene correction based on the development of DNA aptamers capable of binding to a site-specific DNA binding protein to facilitate the exchange of homologous genetic information between a donor molecule and the desired target locus (aptamer-guided gene targeting). We selected DNA aptamers to the I-SceI endonuclease. Bifunctional oligonucleotides containing an I-SceI aptamer sequence were designed as part of a longer single-stranded DNA molecule that contained a region with homology to repair an I-SceI generated double-strand break and correct a disrupted gene. The I-SceI aptamer-containing oligonucleotides stimulated gene targeting up to 32-fold in yeast Saccharomyces cerevisiae and up to 16-fold in human cells. This work provides a novel concept and research direction to increase gene targeting efficiency and lays the groundwork for future studies using aptamers for gene targeting.

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