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蛋白质印迹手册3:印迹原理与优化

【字体: www.ebiotrade.com 时间:2014年5月23日 来源:默克密理博

摘要:

  过滤是将蛋白质上样到膜上的直接方法。一个溶解的样品可以通过抽真空而滤过膜。蛋白质吸附到膜上,而样品的其他组分则穿过膜。或者,将样品直接点在表面上,并让其干燥。固定在膜上的蛋白质随后可用于分析。

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过滤(抽滤)

过滤是将蛋白质上样到膜上的直接方法。一个溶解的样品可以通过抽真空而滤过膜。蛋白质吸附到膜上,而样品的其他组分则穿过膜(图2)。或者,将样品直接点在表面上,并让其干燥。固定在膜上的蛋白质随后可用于分析。

斑点印迹(图3)和狭缝印迹是过滤方法的两个版本,它们采用多管吸印仪(manifold),将样品以斑点状或狭缝状上样到膜上。这些技术被作为快速筛选大量样品的定性方法,或分析相似样品的定量技术。它在测试实验设计参数是否适用于更复杂分析时特别有用。

过滤方法的另一个版本是网格免疫印迹,当样品量非常有限,无法用ELISA等传统技术来开展分析时,这种技术很有用,适合高度并行的样品分析。例如,网格免疫印迹已用于过敏原特异的抗体应答鉴定,只需要极少量的患者血清(Reese等,2001)。

在制备过滤法印迹时,请注意以下方面:

• 去污剂会抑制蛋白质吸附到膜上。样品溶解和清洗所用的缓冲液中的去污剂应不超过0.05%,且只在需要时添加。
• 样品量应足够大,以覆盖每孔中暴露的膜,但又不能超过膜的结合能力。
• 颗粒负载高的样品可能会堵塞膜,而那些高粘度的样品会降低流速。颗粒应通过预过滤或离心来去除,并只将上清上样到膜上。粘稠的样品应用缓冲液稀释。

图2. 利用过滤的印迹系统。

图3. 利用Immobilon® Western 化学发光HRP底物在人血清的斑点印迹上检测转铁蛋白(详见操作步骤1.4 斑点印迹,第40页)。利用山羊抗转铁蛋白抗体(稀释度1:10,0000)和兔抗山羊HRP结合的二抗(稀释度1:50,000),在Immobilon®-P膜上检测连续稀释血清中的转铁蛋白,重复两次。

(实际内容以《蛋白质印迹手册》印刷版为准,如有错漏,敬请谅解)

立即索取印刷版《蛋白质印迹手册》

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(http://www.ebiotrade.com/)

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