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蛋白质印迹手册10:蛋白质鉴定(一)

【字体: www.ebiotrade.com 时间:2014年6月18日 来源:默克密理博

摘要:

  免疫检测利用特异抗体来检测和定位印在膜上的蛋白质。抗原-抗体结合的特异性实现了复杂样品中单个蛋白的鉴定。目前有两种免疫检测的操作:标准和快速。快速免疫检测省去了封闭步骤,缩短了清洗和孵育步骤所需的时间,因而适合快速观察丰度较高的蛋白质。

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免疫检测

免疫检测利用特异抗体来检测和定位印在膜上的蛋白质(图11)。抗原-抗体结合的特异性实现了复杂样品中单个蛋白的鉴定。

在开发一种新的免疫检测操作时,所有成分及它们的相互作用都必须考虑。抗体浓度、缓冲液组成、封闭液和孵育时间必须根据经验来试验,以确定最佳的条件。水的质量对所有步骤都很重要 – 少量杂质可能引起大问题。例如,辣根过氧化物酶的酶活性会被一种即使高纯水也可能有的常见的污染物——热原所抑制,也会被一种常用的抗体溶液防腐剂——叠氮化物所抑制。因为涉及一致性和污染物等问题,封闭液的质量也必须认真考虑。

图11. 基于膜的免疫检测。

标准 vs. 快速的免疫检测步骤

目前有两种免疫检测的操作:标准和快速。

标准免疫检测方法包括下列步骤:
1. 封闭转印膜上未被占据的位点,以防止抗体的非特异结合。
2. 将转印膜与一抗共同孵育,一抗与感兴趣的蛋白质结合。
3. 清洗以去除未结合的一抗。
4. 将转印膜与二抗结合物共同孵育,二抗与一抗结合。
5. 清洗以去除未结合的二抗。
6. 将转印膜与底物共同孵育,底物与二抗结合物相互作用,从而显示蛋白质的位置。

快速免疫检测省去了封闭步骤,缩短了清洗和孵育步骤所需的时间。快速免疫检测方法适合快速观察丰度较高的蛋白质。不过,标准免疫检测提供了更高的灵敏度,并且对于新的样品类型来说需要的优化较少。标准和快速免疫检测方法的操作都在操作3中列出。表6比较了开展两种操作所需的时间。

表6. 标准 vs. 快速免疫检测。

步骤

标准免疫检测

快速免疫检测

1. 封闭膜

1小时

2. 与一抗孵育

1小时

1小时

3. 清洗膜

3 x 10分钟

3 x 5分钟

4. 与二抗孵育

1小时

30分钟

5. 清洗膜

3 x 10分钟

3 x 5分钟

6. 添加底物

5分钟

5分钟

总时间

4小时5分钟

2小时5分钟

(实际内容以《蛋白质印迹手册》印刷版为准,如有错漏,敬请谅解)

立即索取印刷版《蛋白质印迹手册》

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