解读单细胞RNA-seq技术

多年来，跟踪一个单细胞的转录组，超出了我们的能力。但是现在，时代已经变了，新型单细胞RNA-seq方法，可以分析大量的细胞及它们的命运。

　　

生物通报道：多年来，跟踪一个单细胞的转录组，超出了我们的能力。但是现在，时代已经变了，新的单细胞RNA-seq方法，可以分析大量的细胞及它们的命运。

我们都参加过大型生日派对：在拥挤的房间里，与许多人聊天、吃饭和庆祝。但是，试想你并不知道寿星是谁，只是像一个局外者看待这个派对。你可能会觉得整个事件看起来与其他的生日派对没有什么不同。然而，派对上的每个人都在寿星的生活故事里担当独特的角色。所以，如果不知道每位来宾和他们的角色，一个局外人可能就会做出错误的假设，或错认聚会上的人。

复杂器官的细胞成分，有点类似于生日派对。细胞群体在特定的时刻聚在一起，执行关键的功能，形成一种器官。细胞亚群以不同的方式起作用，在特定的时间点履行专门的职责。（如同在聚会上，不同的人带来礼物、吃食或帮助安排活动）。从技术的角度来看，仔细分析这些细胞如何单独起作用，制造一个器官，为研究人员带来了巨大的挑战。但是，随着科学家们不断设计出的巧妙新技术，梳理每个细胞在许多复杂过程中所起的作用，这些挑战都会逐渐消失。

一系列事件
当进入一个生日聚会时，大多数人所做的第一件事情就是，简单的观察，跟来宾交谈。他们是谁？他们做什么？他们来自哪里？他们认识寿星多久了？

在解决“单个细胞如何在复杂系统中起作用”的过程中，科学家采取了相似的路径。他们选择单个细胞并孤立地研究它们。然而，分离单个细胞进行分子分析，非常棘手，而接下来的问题是，一旦分离出它们之后，如何研究它们？那就是，测定特定时刻每个细胞正在制造的RNA转录本，对正在发生的事情获得一个快照。有了足够多的快照，就有可能渐渐弄清复杂的细胞事件和不同生物学过程所需的时间。

单细胞RNA测序（RNA-seq），是从2008年高通量测序变革阴影中出现的新一代测序（NGS）应用，当时有几个实验室报道了测定生物学样本RNA含量的不同方法。在过去的六年中，RNA-seq已经给我们展示了RNA世界的惊人多样性，从我们已经知道的转录合成蛋白质的mRNA，到在细胞中发挥调节作用的非编码RNA。相关阅读：利用RNA-seq研究非模式生物。

早期的RNA-seq研究主要集中在细胞群体，在细胞周期不同时间点的细胞混合物，对其进行测序，以确定正在表达的RNA转录本。而这些转录谱能提供已知的和新的RNA目录，这一信息可告诉你参加聚会的宾客名单。这是一个很好的开始，但没有提供你可能会喜欢的详尽细节。

时间就是一切
哈佛大学医学院的再生生物学和干细胞助理教授John Rinn，致力于探索RNA世界。他已经发现了一些新的功能性非编码RNA（ncRNA），ncRNA一度被认为是跟转录噪声差不多的分子。

长非编码RNA（LncRNA，例如XIST）是一类专门的RNA，其生物学作用最近才开始为人所了解。Rinn称：“我们可以利用单细胞测序，进一步了解XIST的功能。”

在2012年，Rinn的研究小组开始寻找更多功能形式的长非编码RNA，特别寻找充当强大细胞调控因子的RNA。为此，他和同事们应用单细胞RNA-seq，来检测细胞分化这类过程中基因转录的pseudotemporal动力学。通过编目所有的细胞RNA，连同它们在细胞中的出现和消失时间，Rinn希望找到一些有趣的新lncRNA，他能够将特定的功能归因于这些新lncRNA。但是，很奇怪的事情发生了：他发现了无聊的旧mRNA。

Rinn将这些结果发表在今年3月份的《Nature Biotechnology》杂志，介绍了肌细胞生成的6种新细胞调控因子，他解释说：“细胞没有定义明确的mRNA表达模式，它不像‘现在打开’和‘关闭’那么简单。”然而，对Rinn来说最大的惊喜可能就是，他在数据中观察到了基因表达的随机性，相当于在生日聚会上不断来去的人们，每一分钟都在改变着房间的动态。你如何捕捉所有这些变化并分析这些数据呢？

随机性总是为生物学家带来挑战。在这种情况下，在单个细胞之间基因表达数据显示出非常高程度的可变性。生物学变化不是唯一的问题——Rinn也需要考虑测序文库制备过程中的实验可变性。但是可变性也提出了可能性。

Rinn指出：“实际上，可变性和多样性会告诉你调控因子在哪里。”想象一个调控因子不受可变性的影响——这会产生更多的数据可信性。他们的解决方案是，开发一种无人监督的聚类算法，称为Monocle，能够提高单细胞RNA-seq数据的时间分辨率，并处理基因表达数据中的变化。利用Monocle的分类方法，Rinn能够找到六种新的肌细胞生成调控因子，同时解释数据集中的实验和生物学变化。

诸如Monocle的程序的出现，最终会为研究人员提供一种途径，以一种有意义的方式，检测生物学过程的基因表达动力学，使他们能理解来自RNA-seq转录本目录的所有数据，较全面地了解细胞动力学。

准备一个大型聚会
当研究很少数的细胞时，用今天的测序技术和分析平台，去确定在转录级联早期或晚期阶段中正在打开的是什么，是一个相当简单的实验。但是，怎样处理较大数量的细胞，获得更详细的信息呢？

通过在小型生日聚会上与别人交谈，可以了解更多关于寿星的事情。然而，这不难看出，随着聚会越来越大，很难发现那些相同的模式、趋势和信息。如果你只跟一小部分的客人交谈，如果偶然他们告诉我们关于寿星的完全不同的故事、给我们的信息太少，以至于不能建立联系并得出结论，会发生什么情况？显而易见的答案是，我们需要跟更多的人交谈。在单细胞分析中同样如此。

Rinn说：“用200个细胞，你开始了解情况。但是原则上，你采用的细胞越多，分辨率就越高。”分析几百个单细胞全转录组的实验，即使用今天的测序系统，工作量也很大，这还不考虑数据分析在内。

魏茨曼研究所免疫系的Ido Amit面临着这种情况。测定有限数量细胞的转录组，特别是那些已经用特殊细胞标记分离出来的细胞，因此，这对复杂的细胞过程和每个细胞所起的作用，只能提供有限的认识。此外，需要公正的信息来了解从每个分析的细胞所获得的独特转录谱。

为了解决这个通量限制，产生较高容量的转录组数据，Amit及其同事开发出一种大规模并行RNA-seq工作流程，能够同时破译数百甚至数千个转录组，而不需要特定的标记，相关研究结果发表在今年4月份的《Science》杂志。这一工作流程的关键是，能够收集单细胞样本，然后barcode和多重RNA-seq反应。

最初，通过荧光激活的细胞分选（FACS）将单个细胞分类到384孔板中。然后，利用标记的材料和三个级别的barcoding，集中处理细胞。Amit研究小组利用该工作流程，能够测定4000多个小鼠脾脏的单细胞RNA，这些细胞被浓缩用于表达CD11c表面标记。多路复用实验可让1536个细胞在一个单轨道进行测序，在来自每个细胞的200和1500种不同RNA分子之间，产生22000个对齐的读长（reads）。类似于Rinn的发现，Amit的数据也显示大量基因的高度细胞变异，这明确表明，检测的脾脏细胞群具有异质性，并且有机会发现新的调控因子和通路。

近年来，RNA-seq方法和分析工具有了很大的提高，这使得单细胞分析不仅能表明变异存在，也为研究人员提供了一种方法，来了解这一转录变异背后的生物学意义。

（生物通：王英）

生物通推荐原文摘要：
1. The dynamics and regulators of cell fate decisions are revealed by pseudotemporal ordering of single cells
Abstract: Defining the transcriptional dynamics of a temporal process such as cell differentiation is challenging owing to the high variability in gene expression between individual cells. Time-series gene expression analyses of bulk cells have difficulty distinguishing early and late phases of a transcriptional cascade or identifying rare subpopulations of cells, and single-cell proteomic methods rely on a priori knowledge of key distinguishing markers1. Here we describe Monocle, an unsupervised algorithm that increases the temporal resolution of transcriptome dynamics using single-cell RNA-Seq data collected at multiple time points. Applied to the differentiation of primary human myoblasts, Monocle revealed switch-like changes in expression of key regulatory factors, sequential waves of gene regulation, and expression of regulators that were not known to act in differentiation. We validated some of these predicted regulators in a loss-of function screen. Monocle can in principle be used to recover single-cell gene expression kinetics from a wide array of cellular processes, including differentiation, proliferation and oncogenic transformation.

2. Massively Parallel Single-Cell RNA-Seq for Marker-Free Decomposition of Tissues into Cell Types
Abstract: In multicellular organisms, biological function emerges when heterogeneous cell types form complex organs. Nevertheless, dissection of tissues into mixtures of cellular subpopulations is currently challenging. We introduce an automated massively parallel single-cell RNA sequencing (RNA-seq) approach for analyzing in vivo transcriptional states in thousands of single cells. Combined with unsupervised classification algorithms, this facilitates ab initio cell-type characterization of splenic tissues. Modeling single-cell transcriptional states in dendritic cells and additional hematopoietic cell types uncovers rich cell-type heterogeneity and gene-modules activity in steady state and after pathogen activation. Cellular diversity is thereby approached through inference of variable and dynamic pathway activity rather than a fixed preprogrammed cell-type hierarchy. These data demonstrate single-cell RNA-seq as an effective tool for comprehensive cellular decomposition of complex tissues.