让哺乳动物细胞的蛋白表达更高、更快、更强[新品推荐]

自美国FDA批准第一个重组蛋白药物（重组人胰岛素Humulin）上市，至今已过了30余载。近年来，重组蛋白药物在全球处方药市场上所占的比重越来越大。由于糖基化修饰对保持其活性很关键，因此重组蛋白的生产多采用哺乳动物细胞。然而，哺乳动物细胞内的蛋白表达却并非易事，表达量低，不太稳定，周期长，成本高，这都是困扰研究人员的因素。因此，大家往往将蛋白表达的成功与否归结在运气上。

其实，不光讲运气，还要讲实力。对于蛋白表达而言，弄清这其中的原理和影响因素，远比烧高香更有用。大家都知道，在构建重组蛋白时，目的基因往往以随机整合的方式，整合到宿主细胞的基因组中。而外源蛋白的实际表达情况，往往依赖于它的整合位置和这部分染色质的结构。哺乳动物细胞的染色质常常处于关闭、紧密的状态，这种“转录沉默”最终导致外源蛋白产量不高，筛选高产克隆很困难。

为了克服这种位置效应，研究人员也开始尝试引入转录调控元件，UCOE便是其中的一种。UCOE全称为泛染色质开放元件（Ubiquitous Chromatin Opening Element），是一个小的DNA片段，源于看家基因的无甲基化CpG岛。研究表明，UCOE能有效防止基因沉默，不论整合到染色质什么位置，目的基因都能持续稳定、高水平地表达。

大奖在握的UCOE技术

UCOE一开始只是伦敦国王学院Michael Antoniou实验室中的小众技术。之后，密理博（后并入默克集团）获得授权，将其商业化。2007年，UCOE技术被著名咨询公司Frost & Sullivan授予美国药物开发技术市场的年度创新技术大奖（2007 Frost & Sullivan Technology Innovation of the Year Award）。

“总的来说，在使用密理博的UCOE技术后，蛋白质表达水平比传统的哺乳动物细胞表达方法高了10-50倍。密理博的创新方法极大地提高了研究的质量，而UCOE™技术有望对药物开发以及治疗药物的开发和制造产生持久的影响，”Frost & Sullivan的行业分析师Shankar Sellappan博士如此评价UCOE。

的确，UCOE技术使哺乳动物细胞的蛋白表达量有了飞跃。受其控制的基因能很好地克服位置效应而保持活跃的转录状态，从而使目的蛋白能在宿主细胞中获得高产量的表达。

UOCE表达效果

利用UCOE技术，研究人员能够在30天内获得g/L级的目的蛋白，发酵规模达100 L。与传统不含UCOE的载体相比，UCOE技术的应用使得高表达克隆的比例更高。因此，筛选稳定表达克隆的时间大大缩短，仅需1-2个月，筛选不到100个克隆。UCOE技术与目前标准的工业化平台兼容，如CHO细胞、CMV启动子、常用质粒、转染试剂、培养基等。此外，细胞能稳定传代达130代以上。

口说无凭，实验为据。UCOE技术目前已经成功用于抗体、促红细胞生成素（EPO）、GPCR、活性蛋白/酶以及细胞因子的生产。

目的蛋白产量大幅提高

之前发表在《Cytotechnology》上的研究表明，UCOE只需筛选少量克隆，即可在5周内产生200 mg/L的抗体1。图1也显示，UCOE 表达技术能将分泌型EPO蛋白的产量提高9-56倍。在外源基因启动子5’端上游加上一个UCOE 元件，使产量平均提高了20倍以上。CHO-K1细胞经转染和抗生素筛选、培养，评估克隆产量。

更短的时间，更高的产量

图2显示了单克隆抗体的快速生产。利用90 μg抗体表达质粒转染3 x 107 CHO-S细胞。经抗生素筛选，培养并放大到10L。在第16天添加少量新鲜培养物（+opti）。经评估，带UCOE元件的表达质粒的抗体产量得到显著提高。

更便于发现高产克隆

传统的筛选无异于大海捞针，而在使用UCOE技术之后，由于多数细胞均表现稳定高产，筛选高产克隆就显得简便多了。两个载体分别带有抗体的重链和轻链基因，共转染CHO-S细胞，经抗生素筛选，随机选取96个克隆进行抗体产量评估（图3）。

成功表达困难蛋白

雷帕霉素靶点蛋白（mTOR）是个289 kDa的激酶，由于其大小和易被蛋白酶降解，它的表达一直很困难。之前利用传统的表达载体来表达mTOR的尝试往往以失败告终。之后，研究人员利用UCOE技术，以三种不同的培养形式（生物反应器、转瓶、摇瓶）来生产mTOR。3天后，蛋白表达量分别为：81 μg/L（摇瓶）、236 μg/L（转瓶）和500 μg/L（生物反应器）。SDS-PAGE后经考马斯蓝染色的结果如图4所示。这些结果经western blot验证，但数据未显示。

果然，有了UCOE，我们也能成为蛋白表达的实力派。表达周期大大缩短，表达产量大大提高，这不正是我们梦寐以求的吗？无论是发表文章，还是制造产品，UCOE都能助你早日获得成功。

目前，默克密理博提供人和小鼠的UCOE表达载体，供科研使用。若需要商业版的UCOE系列，用于蛋白药物的开发及生产，请联系默克密理博。（生物通 余亮）

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参考文献：

1. Benton T, Chen T, McEntee M, Fox B, King D, Crombie R, Thomas C, Bebbington C. The use of UCOE vectors in combination with a preadapted serum free, suspension cell line allows for rapid production of large quantities of protein. Cytotechnology. 38, 43-46 (2002)