加速干细胞疗法的基因表达分析技术

最近，美国国立卫生研究院（NIH）的研究人员开发出一种技术，将加快干细胞衍生组织的生产。这种方法可同时测量多个基因的表达，使科学家们能够根据细胞的功能和发育阶段，快速地描述细胞。相关研究结果发表在最近一期的美国科学杂志《Stem Cells Translational Medicine》。

　　

生物通报道：最近，美国国立卫生研究院（NIH）的研究人员开发出一种技术，将加快干细胞衍生组织的生产。

这种方法可同时测量多个基因的表达，使科学家们能够根据细胞的功能和发育阶段，快速地描述细胞。该技术将帮助研究人员使用患者的皮肤，再生视网膜色素上皮细胞（RPE，眼睛后面的一种组织，在几种致盲眼疾中受影响）。这种技术还将帮助科学家为个性化治疗找到药物。

NIH国家眼科研究所（NEI）眼睛和干细胞转化研究部门的Kapil Bharti博士指出：“我们对细胞和组织的鉴定能力，已经限制了干细胞疗法的发展进步。这种检测方法扩展了这种能力，并简化了这个过程。”相关研究结果发表在最近一期的美国科学杂志《Stem Cells Translational Medicine》。

RPE是一层与视网膜相邻的细胞，通常被称为视杆细胞和视锥细胞的光感受器位于那里。RPE支持光感受器的功能。几种疾病可引起RPE破裂，进而导致感光细胞和视力的丧失。

Bharti博士用以制造RPE的干细胞是诱导多能（iPS）干细胞，是通过将成熟细胞恢复到未成熟状态（类似于胚胎干细胞）而产生的。iPS细胞可以来自于患者的皮肤或血液细胞，被诱导为其他细胞类型（例如神经元或肌肉），从理论上说，这些细胞重新植入后不会引起免疫排斥反应。

为了验明由iPS细胞制成的RPE的“正身”，科学家们用显微镜来确保组织看起来像RPE，用生理学试验来确保组织的行为像RPE。他们还利用一种称为定量RT-PCR的技术来测量某些基因的表达，这些基因指示正在进行中的细胞发育和功能。例如，iPS细胞中SOX2基因的表达高于成熟RPE。

但是，定量RT-PCR只允许同时测量每个样本中的几个基因。Bharti博士与NIH国家推进转化科学中心（NCATS）的Marc Ferrer博士联手，开发出一种多重检测方法，这种方法可以一种高度自动化的方式，同时检测每个RPE样本中的多个基因。该方法基于Affymetrix生物科技公司的市售平台。在试验中，研究人员将微小的DNA片段拴到微珠上，用来捕获当RPE样品中细胞表达基因时所产生的RNA分子。一旦被捕获，来自不同基因的RNA就被贴以荧光标记。

研究人员首先利用来自皮肤活检的细胞，产生了iPS衍生的RPE，然后检测了8个基因的表达，这些基因是发育、功能和疾病的标记。他们利用定量RT-PCR一次一个地检测了每个基因的RNA水平，然后利用多重检测同时测量了多个基因。当进行对比时，这两种检测的结果具有相关性。

然后，研究人员利用多重检测，对iPS衍生RPE 、iPS细胞和从眼睛培养的RPE细胞的基因表达，进行了比较。与iPS细胞相比，iPS衍生RPE表达较低水平的SOX2和较高水平的RPE特异性基因PAX6、RPE65、RDH5、TRPM1和BEST1。与培养的RPE相比，iPS衍生RPE表达较高水平的SOX2和PAX6——两种发育标记，但是表达较低水平的RPE特异性基因，表明一种相对不成熟的状态。

Bharti博士指出：“这份报告演示的原理证明表明，可以利用一种完全自动的高通量检测方法，测量iPS衍生RPE中的相关基因表达变化。一旦有了这种检测方法，研究人员的成本可以减半，可用较少的细胞和较小的溶液体积，增加产出。”

Bharti博士及其NEI的同事，正在与纽约干细胞基金会合作，从老年性黄斑变性（AMD，老年人视力丧失的最常见原因）患者和其他罕见遗传性眼疾患者中产生iPS细胞系。通过一个中央存储库，这些iPS细胞系可被用于整个科学界。Bharti博士将从这些细胞系中产生RPE来研究AMD。

（生物通：王英）

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生物通推荐原文摘要：
A Multiplex High-Throughput Gene Expression Assay to Simultaneously Detect Disease and Functional Markers in Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Retinal Pigment Epithelium
Abstract：There is continuing interest in the development of lineage-specific cells from induced pluripotent stem (iPS) cells for use in cell therapies and drug discovery. Although in most cases differentiated cells show features of the desired lineage, they retain fetal gene expression and do not fully mature into “adult-like” cells. Such cells may not serve as an effective therapy because, once implanted, immature cells pose the risk of uncontrolled growth. Therefore, there is a need to optimize lineage-specific stem cell differentiation protocols to produce cells that no longer express fetal genes and have attained “adult-like” phenotypes. Toward that goal, it is critical to develop assays that simultaneously measure cell function and disease markers in high-throughput format. Here, we use a multiplex high-throughput gene expression assay that simultaneously detects endogenous expression of multiple developmental, functional, and disease markers in iPS cell-derived retinal pigment epithelium (RPE). We optimized protocols to differentiate iPS cell-derived RPE that was then grown in 96- and 384-well plates. As a proof of principle, we demonstrate differential expression of eight genes in iPS cells, iPS cell-derived RPE at two different differentiation stages, and primary human RPE using this multiplex assay. The data obtained from the multiplex gene expression assay are significantly correlated with standard quantitative reverse transcription-polymerase chain reaction-based measurements, confirming the ability of this high-throughput assay to measure relevant gene expression changes. This assay provides the basis to screen for compounds that improve RPE function and maturation and target disease pathways, thus providing the basis for effective treatments of several retinal degenerative diseases.