多种工具帮你玩转自噬研究

生物通报道：自噬是细胞进行废物利用的一个重要途径。如果没有及时倒垃圾，屋子里的气味肯定不够好闻。同理，如果自噬过程出现调控异常，就会导致感染、癌症、糖尿病等多种疾病。

细胞通过自噬将受损、变性或衰老的蛋白质以及细胞器运输到溶酶体进行消化降解。不过一直以来，人们对这一系列高度保守的复杂事件还并不了解。近年来，细胞自噬已经成为了继细胞凋亡之后，生命科学领域的又一热门研究方向。

细胞通过自噬降解自己的内容物，包括错误折叠的蛋白、受损的线粒体和受到病原体感染的成分等等。自噬的调控和选择机制一直是相关领域的研究热点。本文介绍了自噬研究中的一些常用工具，希望能让你的实验事半功倍。

抗体

特异性抗体常被用于检测自噬过程所涉及的蛋白、激酶和酶底物。Novus公司提供有大量的单克隆和多克隆抗体，覆盖了自噬的整个过程。研究者们可以通过这些抗体，获得特定分子或信号通路的定量和定性信息，该公司的产品经理Mike Fan介绍道。

CST公司（Cell Signaling Technology）也在推广专为自噬研究所设计的抗体。“我们不仅提供靶标关键自噬标志物的抗体（如LC3），也提供许多针对信号通路的抗体，”CST公司的研发带头人Gary Kasof说。举例来说，mTOR、AMPK和ULK1都是与自噬信号通路有关的激酶，而CST有专门针对这些激酶关键磷酸化位点的抗体。（延伸阅读：PNAS：自噬帮肿瘤抵抗化疗）

据Kasof介绍，CST的绝大多数自噬抗体是单克隆，比多克隆抗体性能好可靠性也更高。“以LC3抗体为例，我们花费大量时间开发了适合免疫荧光的单克隆抗体。LC3抗体主要用于自噬体的检测，因此抗体的质量很关键，”他解释道。

染料

荧光染料是研究自噬的另一个重要工具。Thermo Fisher公司的Premo™ Autophagy sensors和CellLight®试剂，“在通常抗拒基因递送的细胞中也能起到很好的效果，比如原代人类细胞和神经元，”该公司的资深市场开发经理Stephen Oldfield说。Premo Autophagy Sensor可以检测自噬早期，LC3B蛋白从细胞质到细胞膜的招募。此外，Premo Autophagy Sensor Tandem LC3B还可以告诉我们，LC3B呈阳性的囊泡中pH是酸性还是中性。                                                          立刻了解Autophagy sensor的最新信息

“将单色的LC3B嵌合蛋白与细胞器染料结合起来（如MitoTracker、LysoTracker、或CellLights®荧光蛋白），可以为研究者们提供更多的生物学信息。”Oldfield说。

据Oldfield介绍，该公司的自噬研究工具主要用于荧光显微镜、高内涵成像系统或酶标仪。“研究人员可以通过上述设备对自噬过程进行监控，”他说，Thermo Fisher公司还推出了一款以时间分辨FRET为基础的高通量筛选自噬分析产品。

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Cyto-ID®自噬检测试剂盒是Enzo公司的拳头产品，该产品通过荧光示踪物“来检测自噬通路中的各种囊泡，”Enzo 公司的资深市场经理Courtney Noah说。“该产品可用于流式细胞仪，不需要转染就能对自噬进行定量分析。”

这个试剂盒允许用户在荧光显微镜下跟踪活细胞的自噬过程，或者用流式细胞仪进行高通量筛选，它甚至能够标记原代细胞。“该产品可以进行自噬通路的动力学分析，为人们展现自噬体形成和消除之间的平衡，”Noah说。Cyto-ID®自噬检测试剂盒也可以与检测其他细胞器的染料结合起来使用，比如线粒体和溶酶体。举例来说，使用Cyto-ID®绿色自噬染料与Mito-ID® Red，可以区分自噬和线粒体自噬。细胞通过线粒体自噬选择性降解受损（或不再需要）的线粒体。

慢病毒生物感应器

EMD Millipore公司为用户提供了一系列自噬分析工具，除了特异性的自噬抗体，还有自噬诱导物和自噬抑制物。诱导物一般通过阻断自噬的抑制通路起作用，而抑制物则是阻止自噬体的形成。

此外，EMD Millipore公司还开发了一种生物感应器（biosensors）。这是一种基于慢病毒的GFP-LC3报告细胞系，可用于观测自噬通路的起始阶段——LC3定位到自噬体。研究者们可以通过显微镜或流式细胞仪，观察上述异位事件。该产品有助于研究自噬通路的调控机制，例如可以用自噬诱导物或抑制物处理细胞，然后检测其中表达模式的改变，EMD Millipore公司的神经科学带头人Kevin Long说。

EMD Millipore的FlowCellect™ GFP-LC3 Reporter Autophagy Assay Kits可以帮助用户通过流式细胞仪对自噬进行监控。该试剂盒含有GFP-LC3报告细胞系，用于跟踪细胞的LC3水平。通过选择性的细胞透化，该产品能将胞质LC3和自噬LC3区分开。

EMD Millipore的微流体CellASIC® ONIX平台也是研究自噬的一个有力工具，可以在活细胞成像的过程中控制细胞生长的环境。ONIX采用了以微流体为基础的细胞培养皿，和一个标准的倒置显微镜。用户可以精确控制该系统中各种细胞培养参数（温度、气体浓度等），在动态环境下进行时间序列实验，连续记录实验数据。“自噬往往是微环境诱导的细胞事件，因此可以完全控制细胞环境的CellASIC系统，是研究这一过程的理想工具，”Long说。

“目前，越来越多的研究者开始在表观遗传学调控、氧化应激和细胞凋亡中研究自噬，” Long说。“流式细胞仪成像将会为此提供很大的帮助，”他还指出，基于原位细胞培养的单细胞分析将成为这类研究中的宝贵工具。

（Caitlin Smith撰写/叶予编译）