专家指南：CRISPR实验中如何设计gRNA[心得点评]

CRISPR技术的确在科学界掀起了基因组编辑的狂潮。在Pubmed中快速检索“CRISPR”，目前已有900多项结果。当然，每天还有新的科学家进入这一领域，他们或许有许多疑惑。为此，Addgene请来了Broad研究院的CRISPR专家John Doench和Ella Hartenian，给大家介绍一些使用CRISPR的tips。

开始之前的重要考虑

通过CRISPR技术来编辑基因组带来了许多令人兴奋的选择，不过需要仔细规划才能达到期望的结果。第一个选择在于你希望引入的编辑类型，小的插入缺失（InDel）或特定改变。小的插入缺失最常用于破坏基因的蛋白编码能力，在Cas9核酸酶切割dsDNA后，非同源末端连接（NHEJ）容易出错的性质往往会引入移码突变。特定改变即插入表位或荧光标记，或引入特定突变，必须依赖同源重组（HR）通过外源性模板来修复dsDNA断裂。

如果你有兴趣创建小的插入缺失，任何蛋白上都有许多可能的靶位点。在使用化脓性链球菌（S. pyogenes）的Cas9时，潜在的靶位点是[5’-20nt-NGG]和[5’-CCN-20nt]，因为它同样高效地靶定DNA的编码或非编码链。最好靶定蛋白编码区的N端，而不是C端，因为它出现在越上游，就越有可能创建出一个真正无效的等位基因。不过，在用同源重组修复时，靶位点的选择就有更多的限制；当切割位点距离修复模板的近端>30 nt时，效率急剧下降。

确定靶序列，减少脱靶效应

避免Cas9的脱靶效应是设计sgRNA中关键的一步。尽管控制脱靶效应的规则仍处在起步阶段，但一些准则已经被开发出来，并融入目前的设计算法。以下的生物信息学工具能帮助你确定那些表现出最大的序列独特性的基因组位点：

张锋实验室：http://crispr.mit.edu/
Michael Boutros实验室：http://www.e-crisp.org/E-CRISP/designcrispr.html

此外，如何改善on-target活性，目前还知之甚少。我们似乎不可能完全预测到最特异、最具活性的CRISPR，因此，根据经验检测多个不同的CRISPR，以确定on-target效果和off-target程度，这才是最重要的。

减少CRISPR技术脱靶效应的一种方法是使用两条sgRNA以及Cas9的“切口酶”版本。这种方法有助于提高特异性，从而减少脱靶的dsDNA断裂。不过，此方法的缺点在于需要两个靶位点，这意味着一些特定位置不适合创建dsDNA断裂。当然，如果可能的话，这是基因编辑的首选方法。

CRISPR导入的选择

一旦靶位点确定，我们必须考虑如何导入。通常，CRISPR构建体可以转染到细胞进行瞬时表达，或用病毒感染。如果使用逆转录病毒或慢病毒，不建议将产生的细胞用于长期研究，因为组成型Cas9表达和脱靶效应积累的潜在影响。瞬时表达，如转染、电穿孔，或非整合型病毒（AAV或腺病毒），是建立稳定细胞系的最理想选择。同源重组的修复模板既可以是质粒，也可以是单链oligo，与Cas9和sgRNA共同转染。即使使用CRISPR技术，特定细胞中的同源重组率可能还是很低（<1-5%），因此细胞需要筛选。这一步可能是整个过程中最耗时的部分。

Addgene是一个以促进科学共享为目的的非营利性组织。目前它提供多个实验室的CRISPR载体，详见http://www.addgene.org/。（生物通 余亮）

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