代谢组学:一项艰巨的任务

【字体: 时间:2014年07月04日 来源:生物通

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  作为斯克里普斯研究所的博士后,Patti发现证据,暗示大鼠的慢性疼痛模型中存在一种称为N,N-dimethylsphingosine的代谢物,确定此过程为潜在的治疗靶点。为了做到这一点,Patti和他的研究导师Gary Siuzdak攀上了组学树上一个相对年轻的分支,代谢组学。与基因组学和蛋白质组学相似,代谢组学试图分类和量化生物体内的所有代谢物,这可是一项艰巨的任务。

学生化的孩子真是伤不起。糖代谢、脂代谢、核酸代谢,一系列代谢通路,一大堆代谢产物,简直让人头晕眼花。然而,这又不能跳过。毕竟,DNA编码蛋白质,而蛋白质在小分子上发挥其魔力。但很多时候,科学界对这些分子一无所知。

“如果你测定一滴血中的小分子,大约60% 所检测到的峰都无法与任何代谢物相匹配,”华盛顿大学医学院的助理教授Gary Patti谈道。“因此,这是一个令人难以置信的信息宝藏。”

作为斯克里普斯研究所(Scripps Research Institute)的博士后,Patti发现证据,暗示大鼠的慢性疼痛模型中存在一种称为N,N-dimethylsphingosine的代谢物,确定此过程为潜在的治疗靶点1。

为了做到这一点,Patti和他的研究导师Gary Siuzdak攀上了组学树上一个相对年轻的分支,代谢组学。与基因组学和蛋白质组学相似,代谢组学试图分类和量化生物体内的所有代谢物,这可是一项艰巨的任务。据美国北卡罗来纳州一家代谢组学服务供应商Metabolon的首席科学官Mike Milburn介绍,体内大约有2500-5000种小分子。代谢组学的研究人员通常利用质谱或核磁共振(NMR)来探索这些小分子。

Siuzdak和Patti利用质谱来研究大鼠模型中损伤部位周围以及血液中的小分子。通过计算筛选那些图谱,他们鉴定出丰度与表型(这个例子中是疼痛)相关的化合物。如果你也有意开展代谢物图谱分析,请继续往下读。我们将介绍代谢组学领域的工具、技术和发展趋势。

质谱工具

代谢组学研究中的两大关键技术是质谱和核磁共振。据加州大学戴维斯分校的西海岸代谢组学中心主任Oliver Fiehn介绍,质谱更受欢迎,这主要是因为样品的复杂性。“质谱更容易与色谱结合使用。而NMR之前没有分离,因此你最终会得到更加复杂的图谱,”Fiehn说。同时,NMR也不如质谱灵敏,但更为定量。

Fiehn介绍,在他自己的实验室以及隔壁的核心实验室,他的团队先后使用过12台质谱仪。这包括6台气相色谱-质谱联用仪(GC/MS),其中有3台LECO的GC-TOF,1台安捷伦的GC/Q-TOF和2台安捷伦的四级杆GC/MS;以及6台液相色谱-质谱联用仪(LC/MS),其中有2台安捷伦的Q-TOF LC/MS,1台赛默飞世尔的离子肼,1台赛默飞世尔的LTQ FT-ICR,1台AB SCIEX的LC-QTRAP和1台LECO的LC高分辨率TOF。

每一台仪器都有不同的长处和短处。Fiehn举例说,GC-TOF灵敏又快速,但缺乏准确测定质量的能力,这使得它难以鉴定新颖的代谢物,特别是在发现模式(或无偏向,而不是针对性的)实验中。

“在无偏向的代谢组学中,你看到了许多无法鉴定的信号,它们可能对某些疾病很重要,”Fiehn解释道。“然后,你必须有一台准确的仪器,因此我们使用安捷伦的LC-或GC-qTOF,它能够准确测定质量。”

最近几年,新的质谱仪也在不断上市,以支持代谢组学的流程。

Waters公司的Synapt G2-S是一台四级杆飞行质谱仪,特有离子淌度分离(IMS)能力。IMS是一种仪器内气相分离策略,它能够利用分子碰撞截面特性(collisional cross-section)来分辨分子,甚至是化学性质相同(但构象不同)的分子。Waters负责药物开发的主管James Langridge谈道:“IMS是一种非常、非常强大的东西。如果你试图鉴定一种未知的代谢物,碰撞截面提供了更大的特异性。”

据Langridge介绍,目前通过质谱仪主要开展三种类型的代谢组学研究:非靶向代谢组学(untargeted metabolomics),它以无偏向的方式扫描代谢物,了解其丰度在某些情况下的变化;靶向代谢组学(targeted metabolomics),其中研究人员定量特定的已知代谢物;以及空间代谢组学(spatial metabolomics),它研究小分子在组织切片中的空间分布。


空间代谢组学是通过一项称为“质谱成像”的应用实现的,它通过样品内的光栅扫描来逐点收集光谱,以便从空间上确定代谢物位于组织中的何处。据Langridge介绍,MS成像通常是利用MALDI质谱仪完成的,MALDI Synapt G2-S可通过MALDI-HDI成像软件实现这一应用。

赛默飞世尔也为代谢组学的研究人员提供了质谱仪。据该公司代谢组学的战略营销经理Yingying Huang介绍,Q Exactive四级杆- Orbitrap质谱仪具有快的扫描速率(12 Hz),高的分辨率(高达140,000 FWHM)和高的质量准确度(1–3 ppm),适用于化合物的鉴定。

赛默飞世尔最近还推出了Exactive Plus质谱仪,它与Q Exactive有些相似,但没有前面的四级杆,适用于代谢物的全面分析。Huang指出,如果需要,Exactive Plus仪器也能升级到Q Exactive。

据Huang介绍,Q Exactive能够胜任代谢组学研究的所有三个阶段 – 生物标志物发现、化合物鉴定和标志物验证。当然,研究人员也可以购买专门的仪器。例如,赛默飞世尔的Orbitrap Velos Pro和Orbitrap Elite擅长化合物鉴定,这要归功于它们的多种裂解策略和串联能力。TSQ Vantage三重四级杆具有出色的检测和定量能力,建议用于验证实验。

了解赛默飞世尔适用于代谢组学的质谱分析平台

数据分析

从各方面来看,对代谢组学而言,难度不在于数据生成,而是数据分析。Langridge认为:“在我看来,代谢组学最大的挑战,与其他组学学科相似,是在信息学的角度 – 如何解释这些数据。”

代谢组的数量有成千上万,而每个化合物可以通过几个峰来表示。取其精华去其糟粕,自然需要复杂的分析工具。

据Milburn介绍,Metabolon每天大约运行300个样品,从每个样品中挑选并鉴定500-1000个代谢物。该公司已经开发出软件,能够自动在三个不同的质谱平台上运行样品,抽出峰值,决定哪些最有趣,并鉴定出它们所代表的分子。

许多质谱厂家也有自己的代谢组学平台。

赛默飞世尔的SIEVE软件是一种差异分析工具,能鉴定代谢组学实验中变化最明显的分子。不过它最有用的功能之一是允许用户校正溶剂背景,比如塑化剂,它常常在处理过程中渗入样品,产生信号。Huang指出,在一个实验中,大鼠血浆样品的代谢组学分析产生了大约20,000个离子信号。通过去除溶剂背景,系统将数量减少到7,000个,在分组到加合物和同位素时更进一步减少到540个。“这帮助我们大大降低假阳性率,”她说。

如果你倾向于开源软件,Siuzdak和Patti已经开发出一个在线的数据分析平台,名叫XCMS-Online 2,3。任何人都可以创建一个账户,将他们的LC-MS数据上传到XCMS-Online服务器,进行分析和查看。即使你没有自己的数据,他们也提供一些数据集示例供你查看,包括可口可乐和百事可乐。

XCMS-Online上的一个新工具是Cloud Plot interactive,它能够比较两个数据集,并图示说明上调或下调,它们的倍数变化,以及这些变化的统计学意义。图表还能链接到Siuzdak的METLIN数据库,它含有超过75,000种代谢化合物(其中11,000种包括质谱数据,是用手工精心收集的)。

据Patti介绍,他的实验室已经开发出其他一些自动化的工具,能快速鉴定化合物。他希望很快能与XCMS-Online整合。“我们希望那些对代谢组学和信息学方法不太熟悉的研究人员也能开展这些实验,”他说。“这确实是我们的目标。”

随着代谢组学工具的不断出现,相信越来越多的研究人员能够实现这一目标。(作者:Jeffrey M. Perkel / 生物通编译)

参考文献

1 G.J. Patti et al., “Metabolomics implicates altered sphingolipids in chronic pain of neuropathic origin,” Nature Chemical Biology, DOI: 10.1038/nchembio, 2012.

2 Tautenhahn, R, et al., “XCMS Online: A Web-Based Platform to Process Untargeted Metabolomic Data,” Analytical Chemistry, 84 (11), pp 5035–5039, DOI: 10.1021/ac300698c, 2012.

3 Tautenhahn, R, et al., “An accelerated workflow for untargeted metabolomics using the METLIN database,” Nature Biotechnology 30,826–828, doi:10.1038/nbt.2348, 2012.

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