新手指南:如何搞定干细胞的低温保存

【字体: 时间:2014年09月17日 来源:生物通

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  不论你用干细胞做什么研究,都离不开低温保存。冷冻可以保存珍贵的干细胞资源,不过冷冻干细胞可不像冷冻已分化细胞那么简单。我们不能简单沿用普通细胞的冷冻试剂和方案。

生物通报道:在过去十年里,多能干细胞成为了多个领域的实用工具,帮助人们探索发育生物学、研究疾病病理和开发细胞疗法。

不论你用干细胞做什么研究,都离不开低温保存。冷冻可以保存珍贵的干细胞资源,不过冷冻干细胞可不像冷冻已分化细胞那么简单。我们不能简单沿用普通细胞的冷冻试剂和方案。

科学家们一开始对人胚胎干细胞进行操作时发现,一次冻融循环之后只有5%的细胞还具有多能性。这是因为压力条件会促使细胞发生分化,Fraunhofer细胞疗法和免疫研究所的Alexandra Stolzing说,“如果保存的干细胞发生了随机分化,就没有价值了。”

另外,冷冻还会激活一个程序性死亡通路,而且在绝大多数情况下添加凋亡抑制剂收效甚微。科学家们一直在试图理解,低温究竟对多能干细胞产生了什么影响,希望在此基础上开发更好的冷冻方法,让更多细胞存活下来。

应该用什么来冷冻干细胞?

这个问题的答案取决于你的细胞系,不过大多数成功的冷冻方案也有一些共同点。人们一般先用蛋白酶来解离细胞,然后进行离心,最后用含有冷冻保护剂的培养基重悬。经典的冷冻保存培养基,由90%的胎牛血清(FBS)和10%DMSO组成,DMSO可帮助细胞抵御冷冻带来的有害影响。但是如果你的细胞要用于人体,上述试剂就不合适了,它们可能有毒会带来副作用。此外,使用90 FBS/10 DMSO混合物时,细胞复苏之后的活性往往较差。近来,研究者们纷纷开始使用无动物源成份的试剂,以及更低浓度的DMSOCaspase抑制剂常被用来避免细胞凋亡。

今年早些时候,RIKEN发育生物学中心的Teruo Akuta等人比较了不同的低温保存方案和试剂,为自己的胚胎干细胞和诱导多能干细胞确定理想的培养基。他们发现,在冷冻前用链霉蛋白酶和螯和剂EDTA处理,可以提高干细胞的复苏率。Akuta指出,干细胞喜欢抱团生长,但冷冻保护剂难以浸透较大的细胞团块,用链霉蛋白酶和螯和剂EDTA可以将细胞分成大小均一的小簇。Akuta团队还改良了商业化的低温保护剂CP-1CP-1含有羟乙基淀粉(植物源的冷冻保护剂)和DMSO。他们通过添加人血清白蛋白和乙二醇,进一步提高了培养基的效力。研究显示,添加乙二醇时的复苏效率最高,有活力的细胞占到44%。不过,这样的组合并不一定适用于任何人。(延伸阅读:ScienceiPS临床应用这次真的来了?

“并没有所谓的最佳冷冻保护剂,”牛津大学的Zhanfeng Cui说。他建议新手们尝试不同试剂,查阅用到了相同细胞系的文献。许多人直接把细胞放在10% DMSO里冷冻,然后等着出现好结果。“花几个小时查文献,就能为你节省大量的时间,”他指出。“培养干细胞是个高成本又费时的过程,我们要尽可能的保护资源。”

冷冻的速度重要么?

绝大多数低温保存方案是,先将样本放在–80 °C冰箱过夜,第二天再转移到液氮进行长期储存。有研究发现,使用程序性的冷冻方法能获得更好的结果。这种方法通过特殊设备,控制样本温度以稳定速度降低(每分钟几度)。不过就算你没有这样的设备也不必灰心,因为也有文章认为最终的细胞产量并没有太大差异。

 


现在还出现了一种新兴的冷冻方法,即玻璃化(vitrification)。玻璃化是指通过超快速冷却,形成糖浆一般的液态而不是结晶的固态。这种方法能避免形成冰晶,但需要高浓度的冷冻保护剂和特殊的设备。

“还是那句话,要反复尝试才能找到最适合自己细胞的方案,” Stolzing说。如果你只有–80度低温冰箱,那么就试着优化培养基提高产量。如果有条件,控制冷却速度和玻璃化冷冻都很值得一试。

应该如何复苏干细胞?

在理论上,细胞在–196 °C的液氮中可以稳定存在很多年。激活细胞死亡和分化通路的是冷冻和复苏过程。因此,复苏干细胞的时机完全取决于你自身的需要。冷冻过程需要慢而稳,而细胞复苏要很快。

“对于细胞复苏而言,速度是很有必要的,”Stolzing说。“现在大家都在追求快速复苏。”

干细胞的试管可以放在37°C水浴中解冻,然后用生长培养基重悬。如果想除去DMSO,还可以洗几个循环。细胞复苏之后,最好用几天时间来培养,筛查它们的功能是否正常。

我能得到怎样的产量?

如果幸运的话(你的干细胞系特别有活力),第一次进行冻融可能会得到40%50%甚至更高的产量。但是如果你的产量只有10%左右甚至更低,也完全用不着惊讶。方法的优化往往需要多次尝试,Cui说。

另外计算产量不要操之过急,佛罗里达州立大学的Yan Li提醒到。“最初的细胞活力可能有误导性,”她说。“细胞解冻之后有时要过一会儿才开始死亡,你可能会最终失去植板的细胞。”研究显示,细胞死亡在植板后大约24小时达到高峰,因此最好等一等再来计算产量。

复苏后的细胞还是干细胞么?

“对于干细胞而言,复苏得到活细胞并不是我们的最终目标,”Cui说。“关键问题是,这些细胞是否丧失了多能性。”除了在显微镜下分析形态,观察细胞植板后的生长模式,他还建议在冻融循环前后用相应标记(例如Oct-4)进行染色。这样我们就能够了解干细胞的分化情况。在细胞复苏后,也可以通过商业化芯片来检测拷贝数变异、表观遗传学改变和染色体畸变。

复苏的产量低没什么大问题,我们只需要培养更多细胞就行。但是我们不能假定存活下来的细胞与原始细胞相同,特别是在产量很低的情况下。“存活下来的细胞可能经过了某种选择,” Cui说。“我们正在尝试理解这个问题。”

 

生物通编辑:叶予

生物通推荐原文:

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