科学-转化医学：单分子测序解析超级细菌

　　

生物通报道 美国国立卫生研究院（NIH）和Pacific Biosciences的研究人员利用PacBio的单分子实时（SMRT）测序技术，解析了与肠杆菌（Enterobacteriaceae）相关的医院获得性感染中质粒介导的抗生素耐药性。这项成果发表在最新一期的《科学-转化医学》上。

研究人员从2011年爆发“超级细菌”的NIH医院中采集了革兰氏阴性的肠杆菌分离株，并分析了其中含有抗生素耐药性酶的质粒。他们的研究结果显示携带这些耐药基因的背景质粒的广泛多样性，且许多耐药性相关的质粒来自医院环境内或外的独立来源。

最近几年，美国频频出现“超级细菌”感染。这种细菌名为抗碳青霉烯类肠杆菌（carbapenem-resistant Enterobacteriaceae，简称CRE），因对碳青霉烯类广谱抗生素具有极强的耐药性而得名。

为了鉴定肠杆菌携带的编码碳青霉烯酶的质粒，以及它们在细菌物种之间的移动，研究人员对临床和医院环境的肠杆菌分离株进行了全基因组测序，如肺炎克雷伯菌，产酸克雷伯菌和大肠杆菌，它们都含有一个或多个碳青霉烯耐药的质粒。

研究小组主要关注与碳青霉烯酶相关的耐药性，这涉及到所谓的KPC基因。研究人员解释道，2011年NIH临床中心有18名患者感染肠杆菌，其中就携带了包含KPC的质粒。

肠杆菌的碳青霉烯耐药性也来源于另一种质粒，它包含由NDM1基因编码的碳青霉烯酶。文章的通讯作者之一，国家人类基因组研究所的Julie Segre解释道，这种质粒在东南亚较为普遍。在2011年爆发“超级细菌”后，NIH中心未检测到这种质粒。

在此次分析中，研究人员从NIH临床中心的近1100名患者身上采集了样本。这包括直肠、咽喉和/或腹股沟拭子，在2012-2013年期间从医院的重症监护室和高危内科病房的患者中采集（每周两次），以及从其他病房中采集的监控样本（每月一次），和新入院患者的样本。

当他们筛查超过14,200个患者样本及数百个从医院环境中采集的样本时，研究小组追踪到10名患者，携带了包含KPC阳性质粒的肠杆菌。还有两名患者在出院后被检测出KPC肠杆菌呈阳性。

研究人员之前试图利用短读取（short-read）测序技术对含有KPC的质粒进行测序和追踪，但遇到了一些问题。Segre解释道，部分原因在于含有抗性基因的质粒往往含有大的、移动的遗传元件。

她指出，以这项研究中的碳青霉烯耐药性质粒为例，KPC基因的两侧伴有Tn4401转座子，伸出去多达10,000个碱基。因此，在试图鉴定每个细菌细胞中的多个质粒时就面临挑战。为了解决这个问题，研究人员决定利用PacBio的RSII系统来产生单分子的长读取，这让他们能够同时查看细菌基因组的序列和质粒的序列。

利用这种方法，他们对2012-2013年鉴定出的12名KPC阳性患者的分离株进行了测序，同时对2011年爆发期间采集的2个分离株和医院内的6个环境监控样本进行了测序。

总的来说，这些序列代表了克雷伯氏菌属（Klebsiella）、肠杆菌属（Enterobacter）、柠檬酸杆菌属（Citrobacter）和泛菌属（Pantoea）的物种，以及大小在9,300和379,000个碱基的质粒，这让研究团队能够鉴定潜在的传播事件。

研究人员发现，根据共同的遗传特征，2012-2013年仅有1个病例可与2011年的爆发直接关联。相反，研究结果表明，许多碳青霉烯耐药性质粒是在各中心独立引入的，与早期感染没有明确的流行病学联系。让人意外的是，序列数据还说明耐药质粒很少发生水平转移。

尽管质粒的水平转移不如预想中常见，但也有证据表明它在医疗机构中发生。Segre解释道：“我们没有在患者中观察到，但我们确实在[医院]环境中观察到。”这种模式引发了人们对促进或阻碍质粒在不同微生物之间移动的机制的思考，这也是Segre及其同事后续研究的方向。

“我们仍然看到这些质粒在移动，”Segre说，并指出基因组学研究“让我们能够开展我们想做的基础生物学实验”来了解这些过程。

研究人员也在尝试模拟医院生物膜的情况，以便弄清楚哪些情况可能会促使含KPC的质粒转移到一个新的微生物宿主。“我们如今能在完全测序基因组的背景下开展研究，因为我们了解每一个质粒和它所携带的，”Segre解释道。

在NIH临床中心，研究人员还在继续对新入院的患者以及重症监护室和其他病房中的患者进行积极监控。

对于目前的研究，每个样本的测序价格大约是1200美元，但Segre指出，一旦所有质粒的完整参考基因组都产生，还是能够在高通量的短读取仪器上开展更经济的测序。

为此，她和她的同事正着手建立一套质粒参考基因组，作为国家监控工作的一部分，旨在遏制抗生素耐药性在医院内外的扩散。（生物通 薄荷）

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原文检索

Single-molecule sequencing to track plasmid diversity of hospital-associated carbapenemase-producing Enterobacteriaceae

Sci Transl Med 17 September 2014:
Vol. 6, Issue 254, p. 254ra126
Sci. Transl. Med. DOI: 10.1126/scitranslmed.3009845