新技术巡礼:进入细胞的别样途径

【字体: 时间:2014年09月25日 来源:生物通

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  细胞生物学家往往需要将外源分子送入细胞进行研究,比如质粒DNA或siRNA。化学试剂、电穿孔和病毒递送系统是目前最常用的三种途径。除此之外,人们还在探索全新的转染方法。The Scientist杂志的这篇文章,就对最新的一些转染产品和方法进行了详细的介绍。

生物通报道:细胞生物学家往往需要将外源分子送入细胞进行研究,比如质粒DNAsiRNA。化学试剂、电穿孔和病毒递送系统是目前最常用的三种途径。

递送方法的选择主要取决于目标细胞的类型,需要递送的分子,以及研究所需的转染效率。“人们用得最多的是最简单的方法——化学转染,”Mirus Bio公司的Josh Snow说。

化学转染试剂旨在减少细胞对核酸的排斥(二者都带负电荷),促使细胞膜通过胞吞、胞饮或融合摄入外源物质。对于容易培养和转染的细胞系来说,传统的化学和物理转染(如电穿孔)就已经足够了。不过化学试剂往往对细胞有毒,转染原代细胞、干细胞或者其他难转染细胞的效率也比较低。虽然病毒递送对许多细胞类型的效率很高,但使用起来比较麻烦,还需要采取特殊的防护措施,对操作者的专业要求也比较高。

目前已经有不少厂家注意到了上述问题,开始开发更有效的细胞转染产品。举例来说,去年一月份Life Technologies发布的Lipofectamine 3000,该产品专门针对“难转染细胞和原代细胞”,该公司的Xavier de Mollerat du Jeu说。Mirus Bio公司也为那些难转染的细胞类型开发了新转染试剂,包括皮肤细胞、神经细胞、乳腺癌细胞和血细胞。

除此之外,人们还在探索全新的转染方法。The Scientist杂志的这篇文章,就对最新的一些转染产品和方法进行了详细的介绍。(延伸阅稳定转染VS瞬时转染

Exo-Fect

System Biosciences

systembio.com

Exo-Fect是一种非脂质体的转染试剂,可将核酸(包括质粒DNAmRNAmicroRNAsiRNA)直接送入事先分离到的胞外体exosome。胞外体是细胞分泌出来进行通讯的小囊泡,能够与其他细胞融合或者经由内吞作用被细胞内化。转染了外源核酸的胞外体,可以成为理想的运输工具,System Biosciences公司的Travis Antes说。

首先,用户需要通过超速离心或者使用商业化的胞外体分离试剂盒来分离胞外体。System BiosciencesLife Technologies等公司都提供有这样的产品。另外,研究者也可以直接从System Biosciences公司买到已经分离好的胞外体。

这个转染方案非常简单,用户先将胞外体、核酸以及Exo-Fect试剂混合在一起,在37度下加热10分钟,然后在冰上冷却半小时。之后可以用另一个试剂将胞外体沉淀下来,将其与转染试剂和未转染的核酸分离。完成整个过程大约需要45分钟,每个转染反应需要约一百万胞外体(应该足以处理六孔板中两个孔的细胞)。

优势:胞外体介导的递送是无毒的,没有引起细胞死亡。胞外体可以递送不同类型核酸的混合物。Exo-Fect转染试剂盒中含有一个荧光标记的非靶向性siRNA,可以用来监控转染和核酸递送的效果。

挑战:在某些情况下,胞外体的分离可能费时费力。这个产品是今年四月发布的,接受广泛检验的时间还没那么长。细胞培养中常用的胎牛血清(FBS)含有大量的胞外体,会干扰胞外体介导的分子递送。System Biosciences公司推荐用户使用去除了胞外体的FBS

成本:Exo-Fect试剂盒售价是10个转染反应$19520个反应$350。胞外体分离试剂盒$288起,50 mL去除了胞外体的FBS$153。预先分离好的胞外体$350起,一个管大约含有一百万胞外体。

CellSqueeze

SQZ Biotechnologies

sqzbiotech.com

CellSqueeze2013年上市的一个微流体系统,能够将各种物质(包括siRNA、药物、蛋白或纳米颗粒)送入几乎任何细胞。这个矩形微流体芯片含有75个并行通道,每个通道直径30微米,其中设计有小于细胞直径的窄道。

当细胞挤过窄道时,质膜会暂时出现孔洞,允许细胞外的分子通过扩散进入细胞质,之后细胞膜又会很快闭合。这种方式“看来并未对细胞产生任何长期的副作用,”SQZ的创始人之一,哈佛医学院的博后Armon Sharei说。

 


CellSqueeze微流体系统带有一个压力调节器,可以控制细胞在通道中的流速。芯片上方还有两个与出入口相连的细胞池。用户只需要把转染物质加入到细胞中,再将混合液填入细胞池,就可以启动压力运行整个系统。样本流过整个系统只需要大概五秒钟,Sharei说。

优势:使用简单而且速度非常快,Ragon研究所的Morgane Griesbeck评价道,他正在用这个设备递送重组蛋白。CellSqueeze适用于多种细胞类型,包括传代细胞系、胚胎干细胞等。还能同时递送多种物质。

该公司提供了16种长、宽和窄道数不同的微流体芯片,用户可以变动这些参数根据自己的实验进行优化。经验证,CellSqueeze能够可靠递送2 MDa的分子,“我们目前就测试了这么大的分子,可能更大的物质也能进入细胞,”Sharei说。

与传统递送策略不同的是,整个过程不需要缓冲液或载体,而这些都可能对细胞产生毒害。

挑战:该系统目前还不适合递送DNAmRNA。“mRNADNA都能够进入细胞,但有某种东西阻碍了它们的表达,”Sharei说。“我们已经找到了症结所在,并通过初步试验解决了这个问题。”

CellSqueeze的细胞池最大容量为250 μL,更大体积的样本需要分批进行。操作这个设备需要先经过两三次培训。另外该设备的支架慢慢会变松,需要定期更换,Griesbeck提醒道。

成本:每个微流体芯片售价$50CellSqueeze入门款试剂盒含有压力系统和两个支架,售价为$3,000。现场的新手培训需要大约$800$1,000。这个系统目前只发售给“得到认可的合作伙伴”,Sharei说。在购买之前用户需要咨询该公司的科研团队。

GNOME(金纳米颗粒介导的激光转染)

Leibniz University Hannover, Germany

GNOME转染方案主要是通过短脉冲激光,在细胞膜上刺出微小的孔洞,使细胞外的分子能够扩散进入细胞质。研究者们尝试这一策略给细胞递送分子已经有十多年了,但传统方案的速度非常慢通量也很低。

Dag Heinemann及其同事首先将细胞与直径约200 nm的金纳米颗粒共同孵育,让它们慢慢沉积到细胞上。三个小时之后,研究者们用短脉冲的绿色激光束照射样本。这一过程在研究者自制的自动化设备中进行,该设备带有能够移动培养皿的自动载物台和软件,以便快速照射样本。

吸收了这些光之后,金颗粒中的电子会快速震荡并发热。研究者们还不完全清楚之后发生了什么事件,不过结果是细胞膜上出现了孔洞。Heinemann的研究团队使用这一技术将siRNA引入了犬类的癌细胞系,对一个基因进行了有效的knocked downPLoS One, 8:e58604, 2013)。据估计,差不多有90%的细胞被成功转染,处理之后的细胞超过80%仍有活性。

优势:GNOME转染非常温和,“我们获得了很高的细胞活性,敏感细胞一般也能达到90%,”Heinemann说。

GNOME可实现高通量,能够在四五分钟以内处理一个96孔板的细胞。

兼容多种细胞类型,而且高度可重复,“因为物理过程可以始终如一,而细胞并没有积极的参与其中,”Heinemann说。他与其他团队合作,已经成功转染了好几个难以转染的细胞系,包括原代神经细胞、心肌细胞和干细胞。

除了转染siRNAHeinemann还用这一方法向细胞内递送了蛋白、小分子以及合成的寡核苷酸(morpholinos)。

挑战:GNOME递送质粒DNA和其他较大的分子效果不佳。“质粒对于我们在细胞上开的孔而言太大了,”Heinemann说。

另外,金颗粒最终会进入细胞,这有可能会改变细胞的行为。“但就我们所知,这些颗粒在生物学上是完全惰性的,它们不会对细胞产生影响,”Heinemann说。

这一技术还处于试验阶段。Heinemann正在开发简单按键就可以操作的用户友好型样机,希望可以放在细胞生物学实验室里使用。他预计可以在一年内完成这一系统。

成本:现在这一系统还没有定价,不过Heinemann估计这一设备将能与电穿孔系统竞争,电穿孔系统一般零售价在$10,000以上。

(特别提示,文中列出的价格均非国内售价)

 

生物通编辑:叶予

生物通推荐原文:

Entry Requirements

Recent developments in cell transfection and molecular delivery technologies

 

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