流式分析不得不看的5个tips[心得点评]

【字体: 时间:2014年09月09日 来源:生物通

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  流式分析,似乎是个不小的挑战,需要知识和经验。了解以下5个tips,能确保你的流式分析少走弯路,尽快获得满意的结果。

1. 降低荧光信号的噪音

对于流式细胞分析的优化,一个关键的步骤是试剂(抗体)滴定。为了获得最佳的结果,你必须确定所需的最低抗体量,以实现抗原结合的饱和。这将有助于你改善荧光信号的特异性和强度,同时最大限度降低背景。如果你同时染多个颜色,那么这一滴定步骤将让你检测到一抗和二抗之间意想不到的交叉反应性。

2. 选择适当的对照

始终要牢记,选择与标记抗体同型的阴性对照,这样你就能确定实验中背景信号的程度。在使用标记的一抗染色,或使用一抗和二抗的组合时,都是如此。为了获得最佳的结果,实验中一定要包含一个未染色细胞的样品(与染色样品平行孵育),这样你就能控制自发荧光的背景。如果可能的话,也包含已知表达目的抗原的细胞,以及不表达目的抗原的细胞,这样有助于确定抗体的特异性。

3. 优化透化和固定,以改善细胞内蛋白质的检测

细胞内的目标让检测更具挑战性,因为它们的要求可不仅仅是抗体特异性,还包括成功跨越细胞膜。细胞固定和透化的优化是一个关键的参数,需要根据经验来判定,以便平衡细胞内结构的完整性和细胞通透性。记住,始终使用新鲜制备的甲醛溶液来固定,并尝试使用温和的去污剂。如果固定和透化步骤需要进一步的优化,可将甲醛浓度逐步提高至4%,或试试乙醇或甲醇,并使用其他去污剂,如Triton X-100。

4. 染色死细胞,以便从活细胞中获得有意义的数据

死细胞能与任何抗体非特异结合,因此必须要将它们排除在外。最好的方法就是使用一种能穿过受损质膜的荧光染料,从而对死细胞染色。在大多数情况下,特别是在开展细胞内目标的染色时,建议使用与不能存活细胞(non-viable cells)共价结合的染料,这样一旦细胞被透化,它们也不会渗漏出来。

5. 让荧光信号保持在高强度

在开展细胞表面标志物的染色时,我们要考虑到这种可能性,一旦抗体结合,细胞外抗原可能内化。这种自然发生的现象可能对荧光信号的强度产生很大的影响,可通过以下方式避免:

• 使用无聚集物的抗体溶液
• 让你的样品保持冰预冷
• 在染色液中加入叠氮化钠,这样细胞内代谢活性可在染色时下调。也可以考虑使用F(ab)片段形式的抗体

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