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不让Western blot得白板,V3拯救你[新品推荐]

【字体: 时间:2015年01月21日 来源:生物通

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  Bio-Rad的V3 Western流程是在传统的Western流程中引入了创新的免染(Stain-Free)技术。操作过程并没有什么变化,但能够大大缩短整个实验的时间。同时,免染技术让研究人员能看到凝胶和转印膜上的蛋白质,而无需染色,也不会影响免疫检测中的抗体杂交。

Western blot实验的失败,那都是家常便饭。据Bio-Rad统计,大约一半的研究人员表示,他们Western blot的失败率至少在25%。如此高的失败率,难怪会让人心慌慌。况且整个实验流程那么长,辛苦一整天,得到一张“白板”,还真是有点不甘心。

其实,我们会如此焦虑,是因为实验过程中几乎没什么机会来检查结果是否和预期的一致。我们只能通过预染marker来了解大致情况。如果在Western blot流程中加入检查点,确保每一步都获得可靠的结果,那势必能减轻研究人员的焦虑。基于这一考虑,Bio-Rad推出了V3 Western Workflow。

这个V3流程是在传统的Western流程中引入了创新的免染(Stain-Free)技术。操作过程并没有什么变化,但能够大大缩短整个实验的时间。同时,免染技术让研究人员能看到凝胶和转印膜上的蛋白质,而无需染色,也不会影响免疫检测中的抗体杂交。

V3,这代表什么?据Bio-Rad介绍,V3即V+V+V,但这三个V有着不同的涵义。第一个V代表Visualize。在电泳结束后将凝胶放入Bio-Rad的成像系统中1分钟激活成像,即可得到一张类似于考马斯蓝染色的图像,从而判断分离效果。第二个V是Verify。在转印结束后,通过成像系统可以看到印迹膜上的蛋白,从而判断转印的效率。至于第三个V,就是Validate,利用膜上的总蛋白作为内参来进行定量归一化。

加州大学戴维斯分校的助理教授Aldrin Gomes认为,这些检查点的确很有用。“我们能够对凝胶成像,而无需外部染料,并快速确定凝胶上的样品是否有问题。在转印之后,我们同样对凝胶成像,如果任何一步有问题,我们就停下来。”这个停下来,不仅节约了抗体和时间,也是为了总结经验教训后再出发。

V3 Western 流程总共包含五步:

1. 蛋白电泳。利用Mini-PROTEAN® TGX Stain-Free预制胶或Criterion™ TGX Stain-Free预制胶,以及标准的Tris/甘氨酸缓冲液,快速分离蛋白质。TGX Stain-Free预制胶采用一种独特的配方,能够在15分钟内快速分离蛋白质。

2. 观察分离。通过免染技术,将凝胶放入ChemiDoc Touch或ChemiDoc™ MP成像系统中激活1分钟,即可观察蛋白分离。此技术的原理是将蛋白胶浸泡在三氯乙酸或氯仿中,然后通过紫外光照射。在三氯化合物存在时,紫外光驱使色氨酸发生反应,产物会发出可见区内的光,从而实现蛋白条带在胶上的定位。这样无需染色,也能对蛋白分离的情况了如指掌。

3. 蛋白转印。利用TransBlot Turbo转印系统和TGX Stain-Free预制胶,最快3分钟即可完成转印。TransBlot Turbo,又称为全能型蛋白转印系统,一次可转印4块mini胶或2块midi胶。它采用了一种新配方的转印缓冲液,并使用了一种特殊材质的滤纸。这种组合能够承受更大电流,使转印不仅更快,而且更完全。

4. 转印验证。同样,利用ChemiDoc Touch或ChemiDoc MP成像系统,能够对PVDF或NC膜上的蛋白进行观察,即时检查蛋白转印的效果,而不需要丽春红染色。如果转印有问题,那么后续就不需要浪费宝贵的一抗了。

5. Western blot验证。实验当然少不了参照。过去的Western blot实验通常以看家基因作为内参,来确定蛋白质的相对表达量。然而,研究也发现,这些蛋白在病变组织与正常组织间、不同的正常组织间以及同一组织的不同部位都呈现出差异表达。因此,如今人们倾向于选择总蛋白作为内参。利用ChemiDoc Touch或ChemiDoc™ MP成像系统以及Image Lab软件,研究人员能够以总蛋白来进行定量归一化,从而消除实验误差,得到更为可靠的结果。

V3 Western流程中有三款仪器可供选择,包括ChemiDoc Touch、ChemiDoc MP和Gel Doc EZ系统。其中,ChemiDoc Touch是去年底上市的新产品。它采用创新的镜头和光学组件、超高品质CCD,将数字成像系统的灵敏度和图像质量真正提高到胶片级别,能产生可立即发表的图像。如何在这三款仪器中做出选择,请看下表。

成像系统

ChemiDoc Touch

ChemiDoc MP

Gel Doc EZ

检测类型

化学发光以及常规的蛋白和DNA凝胶成像

化学发光、多重荧光以及常规的蛋白和DNA凝胶成像

常规的蛋白和DNA凝胶成像

Western blot灵敏度

+++++

++++

N/A

免染技术

触摸屏/嵌入式计算机

x

x

凝胶形式

mini

midi

mini

midi

mini

midi

以往一整天才能获得的结果,如今借助这些新颖的技术和仪器,6小时就能完成,而且不是白板哦。老板再也不用担心我的Western blot了。(生物通 余亮)

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