精确检测CRISPR脱靶效应的新方法

【字体: www.ebiotrade.com 时间:2015年1月23日 来源:生物通

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  CRISPR和TALENs作为新兴的基因组编辑技术,虽然优势多多,但是仍然被脱靶效应所困扰。美国希望之城贝克曼研究所和浙江大学第一附属医院的研究人员开发出一种新策略,有望帮助人们检测这种意想不到的结果。这项成果于本周在线发表于《Nature Biotechnology》杂志上。

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CRISPR和TALENs作为新兴的基因组编辑技术,虽然优势多多,但是仍然被脱靶效应所困扰。美国希望之城贝克曼研究所和浙江大学第一附属医院的研究人员开发出一种新策略,有望帮助人们检测这种意想不到的结果。这项成果于本周在线发表于《Nature Biotechnology》杂志上。

CRISPR和TALENs技术目前被广泛应用于研究中,而将来更有望用于临床,但脱靶效应的存在始终是个问题。因此,需要有效的方法来确认DNA切割是否在适当的位置。计算机算法和体外选择都能够用来筛查潜在的脱靶位点,但它们往往不能准确预测。

为了开发出一种更好的方法来检测这两种技术的脱靶效应,希望之城的研究人员Jiing-Kuan Yee及其同事使用了一种基于整合酶缺陷型慢病毒载体(IDLV)的技术。这项技术最初由德国癌症研究中心的团队开发,来鉴定锌指核酸酶(ZFN)的意外切割。

在非同源末端连接(NHEJ)的DNA修复过程中,线性的双链IDLV基因组能够优先整合到双链断裂(DSB)中。根据之前发表的文章,这些IDLV能够引入ZFN处理的细胞,标记DSB的位置。之后,利用线性扩增介导的PCR,可定位IDLV的整合位点,揭示IFN是否击中目标位点。

受到这种方法的启发,Jiing-Kuan Yee将其修改后应用于CRISPR和TALENs。“本质上是同一种方法,但我们利用一种不同的方法来产生DNA双链断裂,”Yee谈道。

在他们的实验中,Yee及其同事产生了靶定两个基因的CRISPR/Cas9核酸酶和TALENs。这两个基因分别是Wiskott-Aldrich综合征(WAS)基因和酪氨酸氨基转移酶(TAT)基因。它们突变时会引起疾病。

研究人员利用表达CRISPR/Cas9核酸酶或TALENs的质粒转染HEK细胞,之后转导了IDLV。这个IDLV携带的基因赋予了抗生素和嘌呤霉素的抗性。核酸酶形成DSB后,允许IDLV整合,使得耐受嘌呤霉素的克隆数量增加了两到三倍。

对于CRISPR/Cas9和TALEN处理过的细胞,研究人员在目标切割位点的60 bp内鉴定出成簇的IDLV整合位点(CLIS)。当他们寻找WAS和TAT基因以外的CLIS时,在TALEN处理的细胞中未找到脱靶位点,而在CRISPR/Cas9核酸酶中发现一些。之后他们利用芯片预测和深度测序来确定IDLV分析的灵敏度,发现它能够检测频率低至1%的脱靶切割。

Yee认为,IDLV方法并非完美,因为它不能可靠检测低频率的脱靶位点,但强调这种方法的无偏向性。“这是一个生物学分析;它并非基于哪些可能是脱靶位点的预测,”他补充道。(生物通 薄荷)

原文检索

Unbiased detection of off-target cleavage by CRISPR-Cas9 and TALENs using integrase-defective lentiviral vectors

Nature Biotechnology (2015) doi:10.1038/nbt.3127

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