2014创新产品:可替代PCR的核酸检测技术

【字体: 时间:2015年01月30日 来源:生物通

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  重组酶聚合酶扩增(Recombinase Polymerase Amplification,RPA)技术因有望替代经典的PCR技术,而让人印象深刻。与PCR的频繁升降温不同,这是一种等温扩增,因此能大大加快反应速度。与此相对应的是,它对硬件设备的要求更低,特别适合应用于体外诊断、兽医、食品安全、生物安全等领域。

过去6年,生物通一直在追踪生命科学领域最前沿的创新产品,将其介绍给大家。2014年,生物通继续搜罗新上市的产品,为大家奉上一场技术盛宴。经过一个半月的网页和微信投票以及专家评鉴,2014生命科学十大创新产品终于出炉。

重组酶聚合酶扩增(Recombinase Polymerase Amplification,RPA)技术因有望替代经典的PCR技术,而让人印象深刻。与PCR的频繁升降温不同,这是一种等温扩增,因此能大大加快反应速度。与此相对应的是,它对硬件设备的要求更低,特别适合应用于体外诊断、兽医、食品安全、生物安全等领域。基于这些优势,英国TwistDx公司开发的TwistAmp®核酸扩增产品被评为2014年度的创新产品。

RPA反应的最适温度在37°C - 42°C之间,无需变性,在常温下即可进行。它不需要温控设备,可以真正实现便携式的快速核酸检测。RPA检测的灵敏度很高,能够将痕量的核酸(尤其是DNA)模板扩增到可以检出的水平,且不需要复杂的样品处理。值得一提的是,RPA既可以扩增DNA也可以扩增RNA,还省去了额外的cDNA合成步骤。目前,TwistAmp试剂盒的扩增子长度在500 bp以内,不过,经过优化也能生成更长的扩增子。

基本原理

RPA技术主要依赖于三种酶:能结合单链核酸(寡核苷酸引物)的重组酶、单链DNA结合蛋白(SSB)和链置换DNA聚合酶。这三种酶的混合物在常温下也有活性,最佳反应温度在37°C左右。
 
重组酶与引物结合形成的蛋白质-DNA复合物,能在双链DNA中寻找同源序列。一旦引物定位了同源序列,就会发生链交换反应并启动DNA合成,对模板上的目标区域进行指数式扩增。被替换的DNA链与SSB结合,防止进一步替换。在这个体系中,两个相对的引物启动一个合成事件。整个过程非常快,一般可在十分钟之内获得可检出水平的扩增产物。

这个只是基础,还可以扩展。在这个体系中加入不同的酶和探针,就可以实现多样化的RPA应用。举例来说,在基础体系里添加逆转录酶(TwistAmp® Basic RT),可以对RNA模板进行一步法扩增。将RPA基础体系、专利的exo探针技术和核酸外切酶III结合起来(TwistAmp® exo),能实现数据的实时读取,就像荧光定量PCR一样。【延伸阅读:核酸检测的一场革命,可替代PCR的犀利技术

广泛应用

不难想象,这些优势使得RPA成为低成本的分子诊断检测的出色候选。多个研究团队利用此项技术,已经开发出埃博拉等致命病毒和病原体的检测工具。同时,RPA技术也在HIV检测和癌症研究中大显身手。

需要提醒的是,RPA的引物设计原理虽然与PCR相似,但两者的引物并非能够通用。RPA引物的长度一般为30至35个核苷酸。若使用PCR的引物,则意味着重组率较低。而长的引物也不一定能提高扩增性能,反而还会增加形成二级结构的可能性。如何才能设计出好的RPA引物呢,请看RPA全攻略之引物设计。另外,生物通小编也整理了一些FAQ,相信能帮助你更好地了解这一技术。

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