专访：不可思议的蛋白质相变过程

　　

   曾有位学者说过，生物界中似乎没有哪一个事件的悲壮程度可以与细胞分裂相比拟，因为为了新生命的诞生，老细胞需要撕裂瓦解，而这其中涉及的关键词之一就包括纺锤体。从表面上看，有丝分裂纺锤体（spindle）是一个具有橄榄球形状螺纹的球，它就像大力士海格力克，拉扯着染色体向两极移动，因此不言而喻这种结构在细胞分裂中的重要性了。

 

   然而“在细胞分裂研究领域里，大部分研究都集中在微管（microtubule）和微管结合蛋白如何组装成纺锤体，以及纺锤体如何精确连接到动点（kinetochore）去完成整个分裂过程。在纺锤体外有一层相对独立于纺锤体的物质却被人们忽略，这种物质被称作纺锤体基质（spindle matrix）。纺锤体基质没有具体的结构并且用传统方法难观察到，这些原因也造成了对其研究的难度，”来自美国卡耐基科学研究所的郑诣先教授指出。

 

   大约在2007-2008年间，郑教授实验室跟John Yates实验室合作完成了第一个纺锤体基质蛋白质谱分析。在这个基础上，郑教授实验室又与中科院朱学良教授实验室合作，在朱教授实验室以鼠胚胎干细胞（mESCs）为系统，对纺锤体基质蛋白进行了RNAi筛选，从中找到了可能在细胞有丝分裂（mitosis）中有重要作用的基因BuGZ。

 

   “接下来朱学良教授送了两位学生和博后到我实验室继续我们的合作，专注于研究BuGZ在有丝分裂中的生理功能。在发现BuGZ影响细胞有丝分裂后，朱敎授组又用蛋白质谱分析，发现BuGZ能够结合Bub3. 这个重要提示, 让姜昊博士(朱教授送过来的学生之一)进一步验证BuGZ能够结合与稳定Bub3的蛋白水平，并且在微管的协同帮助下调控Bub3的动点定位，进而影响微管和动点的相互作用来调控有丝分裂的进行，”郑教授说。

 

   姜昊博士补充道，“之后我们又发现BuGZ和Bub3的蛋白水平被泛素连接酶Ubr5(另一个用质谱找到的BuGZ结合蛋白)以及激活的小GTP酶Ran（RanGTP）所调控，并且两者蛋白水平的变化对纺锤体检查点（spindle assembly checkpoint , SAC）的失活有重要影响”。

 

   在长期对纺锤体基质的研究中，郑教授研究组了解了纺锤体基质在电镜下看不到明显的结构。这也是为什么大家对纺锤体基质的存在持怀疑态度的原因之一。

 

   同时他们也发现纺锤体基质在低温的状态下不稳定，这两个现象让他们推想纺锤体基质应该不像已知的微管或微丝那样形成固体结构。有些蛋白质, 特别是那些Intrinsically disordered蛋白质能形成相变（BuGZ也是一个Intrinsically disordered蛋白）。进而他们发现BuGZ在体内体外的条件下都可以发生相变。

 

   所谓“相变”是物质的一种特性，如水、冰和水蒸气之间的转换，这在物理世界早已广为人知，但细胞中蛋白质的相变及其生物学功能还知道的甚少。

 

   “所以我们很多实验方法和条件的探索都没有现成的样板，我们在研究中是‘摸着石头过河’”，姜昊说。

 

   为此他们想了很多办法，用了各种手段，结合细胞生物学，分子生物学以及生物化学等一系列方法，在爪蟾、人的细胞系，以及体外等不同的系统中验证BuGZ和其相变特性的生理功能。

 

   “当然整个研究过程中我们也遇到了很多难题。比如，利用爪蟾成熟卵裂解液和Aurora A磁珠来形成并纯化纺锤体基质，以及在适宜的条件下（体积，温度，纯化和实验方法）来操作接下来的实验都给我们造成了难题。同时，为了让实验结果精确，需要纯化的蛋白尽量在生理条件下和实验过程中不出现降解，这给我们提出了更高的生化表达和纯化上的要求。在研究过程中姜昊和王澍生（另一位郑教授组专注于BuGZ体外相变研究的副研究员）靠阅读现有文献和测试不同的实验条件和方法解决了这些难题，”郑教授说。

 

   经过一系列的实验和尝试，他们发现了一个有趣的事实，BuGZ富含的进化上保守的疏水性区域，能通过分子间的疏水相互作用使BuGZ形成大小不一的液滴状结构，并从水溶液中分离出来。液滴的形成是可逆的，符合物质的相变特征。

 

   姜昊博士解释道，“在温度低的情况下，单个的BuGZ分子内聚成内向封闭的状态，分子间不易相互结合。当温度升高时，单个BuGZ分子会伸展开，将疏水性区域展开，将疏水性氨基酸（例如苯丙氨酸和酪氨酸）暴露出来，BuGZ分子间通过这些疏水区间结合在一起，形成‘小液滴’（liquid droplet）似的物理结构。”

 

   由此研究组成员证明了BuGZ的缺失能在不同系统里能影响微管的组装，纯化的BuGZ能进行相变。进一步将两者的关系结合在了一起，他们发现BuGZ的相变促进了纺锤体基质的组装和纺锤体的形成。从而更进一步地揭示了这个蛋白对纺锤体以及其基质的组装的功能。这项研究也解释了为什么在纺锤体基质里看不到像微管那样的特异的固体结构。这一重要的研究成果公布在顶级期刊《Cell》杂志上，姜昊博士为第一作者之一。

 

   那么到底什么是纺锤体基质？

 

   对于这个问题，郑教授也详细介绍道，“低等生物如真菌进行封闭性有丝分裂（closed mitosis），高等生物如多细胞动物进行半开放或者全开放性有丝分裂（partially open or completely open mitosis）。”

 

   纺锤体基质这个概念就是从开放性有丝分裂引发出来的。人们在1960年代从同步的海胆卵中分离出有丝分裂的纺锤体，并且发现在纺锤体内外有一层非微管的且相对独立的物质结构。这种结构在微管解聚后仍能单独存在并相对维持原来的形状。这些非微管物质被称为纺锤体基质，科学家们也预言这些物质能调节有丝分裂。

 

   纺锤体基质与微管相辅相成，前者促进后者形成正常的纺锤体结构，而后者的聚合又增强前者的组装。通过利用爪蟾成熟卵裂解液做体外纺锤体和纺锤体基质的重组，郑教授与姜昊等人发现越来越多的蛋白是纺锤体基质成分，例如NuMA，Eg5，Dynein，Nudel，Lamin-B以及BuGZ等等。

 

   郑教授说，“目前我们还不知道Lamin-B 以及其它的蛋白质在基质中形成什么样的结构。但是通过我们对BuGZ及其相变特性的研究和发现，我们现在认为BuGZ以及其他结合蛋白在有丝分裂以及纺锤体形成过程中，以微管为平台发生体内环境下的相变，形成类似于‘液胶’（liquid gel）或者‘液滳’（liquid droplet）的与微管连接的结构。

 

   除此之外，这些因子又能结合并富集其它的对有丝分裂有重要作用的纺锤体基质蛋白。我们可以简单形象地称它们为“软建构”。这种软建构与微管一起协同作用，使对分裂过程中不同阶段不同部分起不同作用的关键蛋白在纺锤体附近的区域内富集，并进行有特异性的生化反应，从而使纺锤体形成，细胞分裂高效有序的进行。”

 

   总体来说，郑教授表示，目前主要的问题是纺锤体是细胞内最复杂的大结构之一，光研究微管还不能解释锤体的形成和作用。虽然纺锤体基质有可能帮助解释细胞分裂的机理，但是由于各种原因，锤体基质一直没有得到认可和重视。

 

   “我们希望BuGZ的相变特性在纺锤体以及其基质中的功能可以为该领域的研究开启一扇新大门。相变可能渗透在纺锤体组装以及染色体分离的各个环节和步骤中。相变也可能在生物的其他领域也起到相似的作用。研究相变也会对临床研究有重要意义。

 

   从抑制癌细胞分裂的角度来治疗癌症一直是临床科研的热点，如果我们能了解纺锤体基质的相变物理特性和关键蛋白，我们就可以在体外的条件下形成纺锤体基质的特殊结构，并进一步在这个结构的环境下体外组装纺锤体。我们可以利用这种体外形成的纺锤体更方便地进行筛药，这不但会大大提高筛药工作的效率和降低成本，还会排除药物在体内环境下对细胞间期（interphase）的影响。”

 

采访花絮

郑教授对目前打算投身于生物学科研的学生们说的话：

 

生物学科研以及所有的科研是孤单而艰苦的，作为想投身于生物科研的新生来说一定要认识到这一点，做好心理准备。有毅力有恒心有兴趣并喜欢探索别人没注意到的现象才能真正把科研做好。如果你喜欢探索和历险, 生物学科研是很有趣的。这好比在艰苦跋涉了一座高山之后发现了潆流溪水和锦花茏木的感觉。同时，做科研不能仅仅规行矩步按部就班，要多读多想，在消化了现有的知识背景下，站在一个新的高度去思考这个领域里的各个问题。这样才能知道什么是这个领域里有意义的尝试，什么是这个领域里最关键的问题。中国的科研正在突飞猛进的发展，国家投入了前所未有的人力和物力，中国生物学科研的发展必将突飞猛进日新月异，投身生物学对科研感兴趣的的学生们应该有机会和条件来进行探索性研究并发现生命的奥秘。

（生物通：王蕾）

 

作者简介：

郑诣先

1984年毕业于四川大学生物学系，在西南农业大学执教近3年后赴美国俄亥俄州立大学攻读分子遗传学博士学位，在果蝇中发现一个与微管蛋白（gamma tubulin，对细胞结构与基本功能至关重要）有关的基因（gamma tubulin in Drosophila and humans, Cell, 1991）。随后在美国加州大学旧金山分校做博士后，师从Bruce Alberts教授（美国国家科学院院长），分离和鉴别了r-微管蛋白环形复合体（gamma tubulin ring complex,Nature,1995）。后赴美国卡耐基科学研究所任研究员至今，兼任美国约翰霍普金斯大学生物系教授。

 

郑诣先实验室利用爪蟾成熟卵裂解液，细胞体外培养，果蝇及哺乳动物来研究细胞中心体（微管细胞内成核部位）的结构与功能，在果蝇发现一种微管蛋白包含环状复合体（γTuRC），可在体外使微管成核，并证明其为微管成核的要素。近年来，除研究细胞分裂外，还扩展至干细胞，老年研究，与发育等领域。

 

目前已发表高水平专业论文80余篇，其中以通讯作者在Cell、Nature、Science杂志上发表研究论文10多篇，在国际生物学领域产生了重要的学术影响。

 

朱学良

1985年毕业于中国科技大学生物系，之后留校并在1988年在该校获得硕士学位。1990年赴美，在加州大学圣地亚哥分校病理系及德州大学圣安东尼奥健康科学中心生物技术研究所进行为期四年的博士论文工作，从事肿瘤抑制蛋白Rb功能的研究。1999年成为上海生命科学研究中心研究员，博士生导师。次年转入中科院上海生命科学研究院生化与细胞所。2001年获国家杰出青年称号。科研期间任职《细胞生物学杂志》副主编、《实验细胞学报》、《生物化学与生物物理学报》、《Cell Research》编委、全国膜与细胞生物物理专业委员会委员、上海细胞生物学会理事。其实验室成立最初主要针对Nude/Nudel在有丝分裂期的生化和细胞学的功能进行研究，同时也对NudE/Nudel和Lis1在神经细胞迁移、胞内运输等多种生命活动的作用和机理进行了广泛和深入的探索。现在实验室研究的范围更扩大到在细胞，斑马鱼以及小鼠的系统里对纤毛发生的机理和功能的研究，并发现了新的纤毛病病症及相关基因。目前已发表高水平文章接近40篇，其中以通讯作者在Cell，Nature Cell Biology，Journalof Cell Biology，Developmental Cell等优秀杂志上发表一系列文章，研究成果在国内国际生物领域里产生了重要的学术影响。

 

姜昊

2006年毕业于厦门大学，之后进入中科院上海生化细胞所朱学良教授研究组攻读博士，期间在朱教授实验室以鼠胚胎干细胞（mESCs）为系统对纺锤体基质蛋白进行了RNAi筛选并发现了BuGZ。博士后期以及之后的博后阶段来到郑教授实验室进行BuGZ在有丝分裂中的功能研究。期间在Developmental Cell、Journal of Cell Biology以及Cell杂志上发表了一系列关于纺锤体基质以及BuGZ的有丝分裂功能的文章。

 

 

原文摘要：

 Phase Transition of Spindle-Associated Protein Regulate Spindle Apparatus Assembly

 Spindle assembly required during mitosis depends on microtubule polymerization. We demonstrate that the evolutionarily conserved low-complexity protein, BuGZ, undergoes phase transition or coacervation to promote assembly of both spindles and their associated components. BuGZ forms temperature-dependent liquid droplets alone or on microtubules in physiological buffers. Coacervation in vitro or in spindle and spindle matrix depends on hydrophobic residues in BuGZ. BuGZcoacervation and its binding to microtubules and tubulin are required to promote assembly of spindle and spindle matrix in Xenopus egg extract and in mammalian cells. Since several previously identified spindle-associated components also contain low-complexity regions, we propose that coacervating proteins may be a hallmark of proteins that comprise a spindle matrix that functions to promote assembly of spindles by concentrating its building blocks.