让“不可能”成为现实[创新技巧]

CyTOF和细胞Barcode技术帮助科学家在干细胞领域取得突破

“每个细胞都有太多我想知道的东西， 我一直都在试图检测更多的转录因子、更多的信号通路分子、更多的表面Marker以及更多的样本——而且最好是同时检测它们，这真是干细胞研究者的梦想。”

——斯坦福大学干细胞生物学，Eli Zunder博士

现在，昔日的梦想已经成为了现实中Zunder的日常工作。几年前，Zunder有幸得以在斯坦福大学Garry Nolan教授的实验室中工作，该实验室是最早使用质谱流式技术的实验室之一，很早就开始利用质谱流式系统在单细胞水平进行生理、疾病等状态下的细胞功能研究。

从2009年问世以来，质谱流式技术已经帮助研究人员探索了细胞生物学、免疫学以及疾病发生过程中的诸多基本问题。Nolan实验室不仅为Zunder提供了强大的技术支持，还提供了兼容创造性和严谨性的科研环境，这使得Zunder可以自由的开发新技术，用来开展一些直到最近还被认为是“不可能”的科学研究。

Zunder的日常工作之一是iPSC（诱导多能干细胞）重编程早期阶段的分子机制研究。在这些研究中，单细胞分析是至关重要的，因为在一个重编程培养物中，只有一小部分细胞可以成功的达到iPSC的终末状态。Zunder解释道，问题的关键在于观察诱导培养过程中细胞群体的变化，检测细胞表面和内部活动，然后把这些变化记录下来，找出诱导过程中细胞可能采取的重编程策略。为了完成对细胞诸多参数进行同时检测，Zunder需要借助于质谱流式技术，除此以外，还有另一项他自己技术创新。

 
细胞Barcode技术使得不同本合并在一起进行标记、检测、分析成为可能

在其他工作人员的帮助下，Zunder优化了基于金属标签的“细胞Barcorde”（Mass-tag cell barcording）技术。“细胞Barcorde”让不同样本的细胞带上不同的金属标签，使研究者可以将多个样本混合为一管分析，简化了样本制备的操作的同时，也消除了由于染色和数据收集过程中产生的误差。这样做不仅节约了时间，也使研究者获得更精确的数据，这一点在Zunder开展的这种大型实验项目中显得尤其重要。

当时，Barcorde技术还没有应用于质谱流式领域中，Zunder已经丰富的荧光流式的Barcorde技术经验。采用一种非冗余的二元编码策略，使用镧系金属做为标签，他和同事Bodenmiller一起将这项技术应用于质谱流式。
 
新的基于钯元素元素的Barcorde方案

最近，Zunder对Protocol进行改进，利用钯元素的六个没有放射性的稳定同位素实现对样本进行Barcorde。新的Protocol采用了部分冗余的三元编码方式，研究人员可以根据结果剔除不同样本细胞间形成的二聚体。此外，它还配备有半自动化的debarcorde算法，方便数据的分析。这些改进不仅增加了可用的检测通道，也改进了数据的精确度，使研究者可以利用质谱流式探索更多新的科学问题。

利用细胞Barcorde技术，Zunder利用一次实验就可以探索整个生物系统对多重刺激的反应。他可以同时测量细胞重编程过程中近乎无限的数据点，检测的参数包括细胞内信号通路、转录因子网络以及细胞表面Marker等。通过分析这些数据Zunder找到了重编程过程中可以做为“路标”的蛋白分子，把这些“路标”和其对应的时间点相联系，就能以空前的精细度展现细胞群体随时间的变化。基于此，Zunder发现了细胞重编程过程中一个重要的早期中间阶段。

 
Zunder利用质谱流式描绘的iPSC重编程“路线图”

“Barcorde的方法非常有用，因为我们可以把在实验中收集所有的样品合并在一起检测，” Zunder解释说，“我们可以非常自信的说，在细胞群体中看到的任何变化，都不是样本间的偶然误差。这一点特别重要，尤其是对表达水平相差微小的样本进行分析的时候。”

上文提到的debarcode算法，是与Nolan实验室的同事Rache Finck合作开发的，这个算法可以将采集到的Barcorde数据转化为对应于原始样品的独立文件。半自动化的算法提供了一个快速、准确、重现性好的解码方法，让研究人员绕过的繁琐和主观的手工设门过程。

在探索性实验中，研究人员需要将单细胞数据和细胞二聚体区分开来，这一点非常重要。Zunder要寻找的是细胞群体随时间的发生的变化，他不想把一个细胞二聚体当成一个没有报道过的新细胞类型。哥伦比亚大学的Dana Pe’er提出了Hamming 编码的想法，这启发了Zunder，他对原来的技术进行了改进，使用了冗余编码体系，这可以帮助他非常容易的剔除近100%的二聚体数据。

细胞Barcorde技术可以很容易的整合到任何单细胞分析的工作流程。“我们在干细胞的研究中面临的挑战同样适用于其他生物系统的研究，所以Cytof也可以在这些领域发挥类似的功能。”Zunder注意到，“在复杂生物系统的研究中，可以测试的实验条件数量几乎是无限的，你可以考虑不同的处理时间、不同的药物浓度、不同的条件组合，通过对比，你可以掌握你所研究的生物系统究竟是如何运作的。”将质谱流式和细胞Barcorde技术相结合，使得研究者可以自由的获得近乎无限的数据，极大的加快了研究进程。
Barcorde技术的这些优点使其在Zunder工作中不可或缺。“现在这已经是标准的做法，”他说，“在我们的实验室，不论谁跑Cytof样品，都会对样本进行barcorde。”

在2015年初，Zunder和他的团队在Nature Protocols（Vol. 10, No. 2）杂志上分享这一技术。经过斯坦福大学的授权，Fluidigm公司进行了大量的标准化和测试工作，推出了Zunder protocol的商业版本以及Barcorde试剂目录，目前质谱流式的客户都可以方便的使用。
 
细胞Barcorde和数据的Debarcorde已经成为CyTOF实验流程的重要组成部分

对于这一产品的推出，Zunder非常高兴。当初他和同事一起使用Barcorde标记时，需要冒各种风险，当出现问题时，需要根据结果调整实验方案。“在一开始优化Barcorde实验方案和试剂时，我们需要仔细的排查问题原因、测试体系的重复性。”现在只需要有Fluidigm的标记试剂盒，任何质谱流式实验室都可以直接使用该技术，而不需要重复他们艰苦的优化过程。

在Zunder看来，质谱流式和细胞Barcorde技术在干细胞生物学领域取得的发现令人振奋，未来还将进一步推进干细胞治疗以及再生医学的发展。“每个人都知道单细胞分析是我们需要的，但是相关技术并不总是那么容易获得或者使用，”Zunder回忆道，“实际上，在CyTOF和细胞Barcorde技术出现前，我想做的实验都是不可能的。”

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