Cell子刊突破：无需克隆的CRISPR新技术

　　

生物通报道  来自荷兰Hubrecht研究所和乌特勒支医学中心（UMC Utrecht）、麻省理工学院的研究人员称，他们开发出了一种自身克隆CRISPR/Cas9(scCRISPR)技术，可以绕开基因编辑过程中所有的克隆步骤，在数小时内完成CRISPR/Cas9介导基因突变及位点特异性转基因敲入。他们的研究成果发布在10月29日的《Stem Cell Reports》杂志上。

CRISPR序列源于原核生物的一种获得性免疫系统，协同Cas（CRISPR-associated）蛋白家族参与抵抗噬菌体或其他病毒的二次感染，广泛存在于细菌和古细菌中。目前已发现三种不同类型的CRISPR/ Cas系统。

当前，研究人员已将II型CRISPR/ Cas系统——CRISPR/ Cas9系统改造成为了一种高效的新型基因组编辑工具，它能够以一种位点特异性方式在培养细胞和整个生物体中实现定向修饰（突变、删除、添加、激活、抑制）特定基因序列。现已在人类、小鼠、斑马鱼、酵母、细菌、果蝇，线虫、拟南芥等物种中得到广泛应用（延伸阅读：张锋Cell子刊：第二类CRISPR-Cas基因组编辑系统）。

在CRISPR介导的基因组编辑中，人们设计出一条可靶向目的基因组位点的单导向RNA (sgRNA)发夹结构，Cas9蛋白在这条sgRNA的引导下完成对DNA的切割。定点诱变和靶向转基因是发育和疾病研究中重要的手段之一，能够轻易地编辑所有基因组位点可彻底地改变遗传和干细胞研究。

目前，CRISPR/Cas9打靶要求为每个新位点克隆出一个位点特异性sgRNA质粒，要在大约1周的时间内完成质粒连接、转化、纯化和序列验证等多个耗时且费钱的步骤。这阻碍了需要进行大规模sgRNA筛查的多重及高通量基因组编辑应用。此外，采用CRISPR/Cas9敲入转基因仍然需要费时地构建通常具有600-6,000 bp同源臂的同源性载体，这一辛苦费力的过程阻碍了建立基因敲入细胞系。这些障碍抑制了大规模靶向基因组操控革命性的潜力。

在这篇新文章中，研究人员提出了一种替代性sgRNA和同源性载体生成新方法，其无需克隆质粒，因此大大缩短了时间，减轻了工作量及CRISPR/Cas9介导基因组编辑的成本，而维持了位点特异性突变和转基因插入的高效率。

这种scCRISPR技术无需为每个靶位点克隆出一条位点特异性的sgRNA或基因敲入同源性载体，可在数小时内完成CRISPR/Cas9介导基因组突变或位点特异性的转基因敲入。研究人员称他们将一种自我切割的回文结构sgRNA质粒，和一条编码所需位点特异性sgRNA的双链DNA短序列导入到靶细胞中，使得它们能够通过同源重组生成位点特异性sgRNA质粒。每个靶位点只需2小时准备时间，相比于基于质粒构建sgRNA，scCRISPR可以低近6倍的成本有效地实现基因敲除（突变率达到88%）。随后，研究人员在小鼠和人类胚胎干细胞(ESCs)及HEK293T细胞中证实了它们的基因组编辑效率。

这种新方法大大简化了生成靶向转基因或基因敲除细胞系的过程，且不影响效率，由此为大规模基因组编辑和筛查应用提供了一个理想的平台。

生物通推荐原文摘要：

Cloning-free CRISPR

We present self-cloning CRISPR/Cas9 (scCRISPR), a technology that allows for CRISPR/Cas9-mediated genomic mutation and site-specific knockin transgene creation within several hours by circumventing the need to clone a site-specific single-guide RNA (sgRNA) or knockin homology construct for each target locus. We introduce a self-cleaving palindromic sgRNA plasmid and a short double-stranded DNA sequence encoding the desired locus-specific sgRNA into target cells, allowing them to produce a locus-specific sgRNA plasmid through homologous recombination. scCRISPR enables efficient generation of gene knockouts (～88% mutation rate) at approximately one-sixth the cost of plasmid-based sgRNA construction with only 2 hr of preparation for each targeted site. Additionally, we demonstrate efficient site-specific knockin of GFP transgenes without any plasmid cloning or genome-integrated selection cassette in mouse and human embryonic stem cells (2%–4% knockin rate) through PCR-based addition of short homology arms. scCRISPR substantially lowers the bar on mouse and human transgenesis.