西南大学将CRISPR用于鱼类遗传学研究

　　

生物通报道：与哺乳动物不同的是，鱼类的性别决定基因在物种之间有所差异，但是，是否有一个共同的分子通路调节着硬骨鱼的性腺性别决定，目前尚不明确。十一月二十日，来自西南大学、日本爱媛大学和美国马里兰大学研究人员，在国际著名遗传学期刊《PLOS Genetics》发表题为“A Tandem Duplicate of Anti-Müllerian Hormone with a Missense SNP on the Y Chromosome Is Essential for Male Sex Determination in Nile Tilapia, Oreochromis niloticus”的研究。这些研究结果强调了TGF-β信号通路在鱼性别决定中的保守作用。延伸阅读：用CRISPR实现斑马鱼高效基因敲入。

本文通讯作者是西南大学生命科学学院院长王德寿教授。王德寿教授博士毕业于中山大学，曾经在以色列巴伊兰大学、荷兰乌德勒支大学、香港中文大学、日本国立基础生物学研究所从事博士后、访问学者和科学研究工作。近年来，对鱼类性别决定与分化有重要作用的芳香化酶基因的表达调控做了开创性的工作，在罗非鱼、青鳉和南方鲇成功克隆了在性别决定和分化中起重要作用的一系列转录因子和类固醇合成酶，并开展了与这些基因有关的功能研究。

主要的性别决定基因（SD）是控制性腺性别分化级联（导致卵巢或睾丸的发育）的关键基因开关。到目前为止，研究人员只在几个脊椎动物物种中确定了主要的SD基因。SRY/Sry是在哺乳动物中发现的第一个性别决定因子。随着最近有研究发现sox3Y是青鳉（Oryzias dancena）的性别决定基因，Sox基因继续在脊椎动物性别决定的讨论中占有重要地位。最近的一些研究表明，转化生长因子β（TGF-β）信号通路的组件，参与鱼类的性别决定。这包括Patagonian pejerrey抗缪勒氏激素(amhy)的一个Y连锁重复，红鳍东方鲀中amh受体（amhrII）的一个突变，和吕宋青鳉（Oryzias luzonensis）中一个性腺细胞源性生长因子（gsdfY）的Y连锁重复。这些研究结果表明了TGF-β信号在硬骨鱼性腺性别决定中的关键作用。

立即索取Life Tech CRISPR载体的最新资料

最近的研究已经为尼罗罗非鱼（Nile tilapia）研究产生了一些重要的资源，包括一段基因组序列、一个微阵列的fosmid文库和几个性腺转录组。TALEN和CRISPR/Cas9基因敲除技术也已经在罗非鱼中构建起来。这些工具的可用性，促使我们尝试在尼罗罗非鱼中分离SD基因。

在这项研究中，研究人员分离出amh基因的一个Y特异性重复基因amhy，并通过转录组分析和Western blot确证了它的雄性特异性表达（XX和XY）。研究人员使用了转基因技术在XX鱼中过表达amhy，并用CRISPR/Cas9诱变在XY鱼中敲除amhy及其受体amhrII。

这项研究表明，amhy可诱导尼罗罗非鱼的雄性性别决定。Amhy的编码序列与X连锁的amh (amh)相同，除了一个错义SNP（C/T），它能改变N末端区域中的一个氨基酸（Ser/Leu92）。amhΔ-y在启动子区域包含几个插入和缺失，甚至exonVI的一个5bp插入，导致一个过早终止密码子，从而产生一个缺乏TGF-β结合结构域的截断蛋白产物。

研究人员用CRISPR/Cas9技术敲除了XY鱼中的amhy，导致雌性对雄性的性反转，而amhΔ-y的突变单独则不能。相反，利用携带amhy/amhΔ-y单倍型的福斯质粒，或在CMV启动子控制下包含amhy ORF的载体，使Amhy在XX鱼中过表达，可导致雌性对雄性的性逆转，而AmhΔ-y在XX鱼中的过表达则不能。anti-Müllerian hormone receptor type II (amhrII)在XY鱼中的敲除，也导致100%的雄性到雌性的性逆转。

总之，这些结果强有力地表明，具有一个错义SNP的复制amhy，是候选的性决定基因，amhy/amhrII信号对于尼罗罗非鱼的雄性性别决定是必不可少的。这些研究结果强调了TGF-β信号通路在鱼性别决定中的保守作用。

（生物通：王英）

生物通推荐原文摘要：
A Tandem Duplicate of Anti-Müllerian Hormone with a Missense SNP on the Y Chromosome Is Essential for Male Sex Determination in Nile Tilapia, Oreochromis niloticus
Abstract: Variation in the TGF-β signaling pathway is emerging as an important mechanism by which gonadal sex determination is controlled in teleosts. Here we show that amhy, a Y-specific duplicate of the anti-Müllerian hormone (amh) gene, induces male sex determination in Nile tilapia. amhy is a tandem duplicate located immediately downstream of amhΔ-y on the Y chromosome. The coding sequence of amhy was identical to the X-linked amh (amh) except a missense SNP (C/T) which changes an amino acid (Ser/Leu92) in the N-terminal region. amhy lacks 5608 bp of promoter sequence that is found in the X-linked amh homolog. The amhΔ-y contains several insertions and deletions in the promoter region, and even a 5 bp insertion in exonVI that results in a premature stop codon and thus a truncated protein product lacking the TGF-β binding domain. Both amhy and amhΔ-y expression is restricted to XY gonads from 5 days after hatching (dah) onwards. CRISPR/Cas9 knockout of amhy in XY fish resulted in male to female sex reversal, while mutation of amhΔ-y alone could not. In contrast, overexpression of Amhy in XX fish, using a fosmid transgene that carries the amhy/amhΔ-y haplotype or a vector containing amhy ORF under the control of CMV promoter, resulted in female to male sex reversal, while overexpression of AmhΔ-y alone in XX fish could not. Knockout of the anti-Müllerian hormone receptor type II (amhrII) in XY fish also resulted in 100% complete male to female sex reversal. Taken together, these results strongly suggest that the duplicated amhy with a missense SNP is the candidate sex determining gene and amhy/amhrII signal is essential for male sex determination in Nile tilapia. These findings highlight the conserved roles of TGF-β signaling pathway in fish sex determination.