用CRISPR制备视网膜神经细胞

最近，美国约翰霍普金斯大学的研究人员，开发出一种方法，能有效地将人类干细胞转化为视网膜神经节细胞。这些细胞的死亡和功能障碍可导致一些疾病患者的视力丧失，如青光眼和多发性硬化症。相关研究结果发表在最近的《Scientific Reports》。

　　

生物通报道：最近，美国约翰霍普金斯大学的研究人员，开发出一种方法，能有效地将人类干细胞转化为视网膜神经节细胞——位于视网膜内的神经细胞类型，可将来自眼睛的视觉信号传递到大脑。这些细胞的死亡和功能障碍可导致一些疾病患者的视力丧失，如青光眼和多发性硬化症。

本研究负责人、约翰霍普金斯大学医学院眼科学教授Donald Zack博士指出：“我们的工作不但会让我们更好地了解视神经的生物学，而且也给我们带来一个细胞为基础的人体模型，可用于发现阻止或治疗致盲疾病的药物。而且，最终它可能会促进细胞移植疗法的发展，恢复青光眼和MS患者的视力。”

相关研究结果发表在最近的《Scientific Reports》，使基因修饰的一个人类胚胎干细胞系，在分化为视网膜神经节细胞后变得发亮，然后使用该细胞系用于开发新的分化方法，并表征所得到的细胞。

研究人员利用称为CRISPR-Cas9的基因组编辑工具，向干细胞的DNA中插入一个荧光蛋白基因。这种红色荧光蛋白只有在一个基因（Brn3b（Pou4f2）表达的时候才会被表达。BRN3B在成熟的视网膜神经节细胞中表达，所以一旦细胞分化成为视网膜神经节细胞后，在显微镜下会显现出红色。延伸阅读：首次用CRISPR制备微型肾脏。

接下来，他们使用了一种称为荧光激活细胞分选的技术，将新分化的视网膜神经节细胞从不同细胞的混合物中分离出来，成为一个高纯度的细胞群体以供研究。Zack说，表现出生物学和物理学性质（在视网膜神经节细胞中可见）的细胞自然地产生。

研究人员还发现，在这一过程的第一天添加一种天然植物化学物质（称为毛喉素forskolin），可帮助改善细胞转化为视网膜神经节细胞的效率。研究人员警告说，毛喉素——也被广泛用作一种减肥剂成分和肌肉补充剂，被吹捧为多种疾病的中药疗法，但其用于失明或其他障碍的治疗或预防的安全性和有效性，并没有科学证据。

本文第一作者、约翰霍普金斯大学毕业生、Novartis制药公司博士后Valentin Sluch指出：“在培养的第三十天，在荧光显微镜下有明显的可见细胞团块。”在到Novartis之前，Sluch在约翰霍普金斯大学完成了本项研究。

Sluch说：“当它首次起作用的时候，我非常激动。我从显微镜边跳起来跑去告诉我的同事。现在看来，我们可以把细胞分离出来，并在一个纯培养物中研究它们，这在以前是不可能的。”

Zack说：“我们真的认为这只是一个开始。”在利用CRISPR的后续研究中，他的实验室希望找到对神经节细胞存活和功能非常重要的其他基因。他表示：“我们希望，这些细胞最终能促进开发新的治疗方法，来治疗青光眼和其他形式的视神经疾病。”

为了使用这些细胞为MS开发新的疗法，目前Zack博士正在与约翰霍普金斯大小多发性硬化症中心主任及神经学教授Peter Calabresi合作。

（生物通：王英）

生物通推荐原文摘要：
Differentiation of human ESCs to retinal ganglion cells using a CRISPR engineered reporter cell line
Abstract: Retinal ganglion cell (RGC) injury and cell death from glaucoma and other forms of optic nerve disease is a major cause of irreversible vision loss and blindness. Human pluripotent stem cell (hPSC)-derived RGCs could provide a source of cells for the development of novel therapeutic molecules as well as for potential cell-based therapies. In addition, such cells could provide insights into human RGC development, gene regulation, and neuronal biology. Here, we report a simple, adherent cell culture protocol for differentiation of hPSCs to RGCs using a CRISPR-engineered RGC fluorescent reporter stem cell line. Fluorescence-activated cell sorting of the differentiated cultures yields a highly purified population of cells that express a range of RGC-enriched markers and exhibit morphological and physiological properties typical of RGCs. Additionally, we demonstrate that aligned nanofiber matrices can be used to guide the axonal outgrowth of hPSC-derived RGCs for in vitro optic nerve-like modeling. Lastly, using this protocol we identified forskolin as a potent promoter of RGC differentiation.