全新的蛋白相互作用分析工具:NanoBRET™ 技术[新品推荐]

【字体: 时间:2015年12月21日 来源:生物通

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  Promega对BRET方法进行大幅改良。它使用NanoLuc® 萤光素酶作为能量供体,而HaloTag® 蛋白标记的NanoBRET™ 618荧光基团作为能量受体,带来了最新的NanoBRET™ 技术。

在细胞中,蛋白质并不是孤单的个体。大多数蛋白通过与分子伴侣或其他蛋白形成复合物而发挥其功能。因此,在了解细胞的生物学特性时,蛋白质相互作用(PPI)研究就成了重要一环。在药物开发的过程中,这一信息也至关重要,有助于确认药物靶点。

一提起蛋白质相互作用研究,你的脑海中可能马上浮现出:酵母双杂交、免疫共沉淀等技术。的确,这些都是经典方法,可有效检测体内体外蛋白质相互作用。然而,它们不能提供动态的蛋白相互作用信息,似乎还缺乏一些说服力。基于此,共振能量转移这种方法受到人们的青睐。这种能量转移有着严格的距离限制(< 10 nm),特别适合评估蛋白质的相互作用。

它的原理并不复杂,就是两个蛋白分子靠近时,激发态能量从一个荧光基团转移到另一个。生物发光共振能量转移(BRET)和荧光共振能量转移(FRET)都属于这种方法。它们的主要区别在于,FRET涉及到两个荧光基团之间的能量转移,其中一个需要适当光源的外部激发,而BRET在底物被氧化之后发生,因此不需要外部激发。如此看来,BRET相对FRET有不少优点,比如无需激发光,背景更低,也避免了光漂白和自发荧光等问题。

BRET最初是在海洋生物中观察到的,如水母和海肾。之后,人们将其用于动物和植物研究。在BRET技术中,蛋白A融合萤光素酶(通常是海肾萤光素酶),作为能量供体,蛋白B则融合带有荧光基团的标签蛋白,作为能量受体。如果蛋白A和B存在相互作用,加入萤光素酶底物后,萤光素酶发光可以激发邻近的蛋白B的荧光基团发光。如果没有相互作用,那就没有荧光咯。

大幅改良的BRET平台

目前,人们大多使用海肾萤光素酶(Rluc)作为能量供体,黄色荧光蛋白(YFP)作为能量受体,在这之间实现能量转移。然而,Rluc和YFP的光谱接近,产生了明显的背景。这种高背景增加了检测噪音,也降低了灵敏度和动态范围。

于是,Promega对BRET方法进行大幅改良。它使用NanoLuc® 萤光素酶作为能量供体,而HaloTag® 蛋白标记的NanoBRET™ 618荧光基团作为能量受体,带来了最新的NanoBRET™ 技术。

集两大专利于一身的NanoBRET™,可不是闹着玩的。NanoLuc® 萤光素酶的分子量仅为19 kDa(171个氨基酸),更适合于构建融合蛋白。别看它小,它的光信号比海肾萤光素酶高两个数量级,因此极少量也能准确定量,特别适合细胞水平蛋白相互作用的研究。

至于能量受体,Promega利用HaloTag® 蛋白标签技术来构建。在评估了一系列荧光基团之后,他们选择了NanoBRET™ 618配基。它与NanoLuc® 的波长配对更加,使得检测数据更加出众。于是,来自NanoLuc® 供体的明亮的蓝移发光信号耦合到远红移的HaloTag® 受体上后,光谱叠加更佳、信号更强、且与传统的BRET分析相比背景更低。


如何构建载体?

也许你接着要问,NanoBRET™ 性能不错,但操作起来会不会很麻烦。如果你想省时省力,可以选择预构建载体。NanoBRET™ 预构建载体融合了已知相互作用的蛋白的基因,无需你再自行构建载体,可直接用于转染,进行药物作用机理及其他相关的机制研究。

Promega目前提供了许多经过优化的NanoBRET™ 检测,包括表观遗传学检测,可研究溴结构域(bromodomain)与组蛋白的相互作用。此外,转录蛋白、信号蛋白和膜蛋白等方面也有不少产品,具体可登陆Promega的网站查询(www.promega.com)。

如果这其中没有你的研究目标,也不必遗憾,自行构建就是了。相信对大家来说,这种克隆是so easy,况且Promega也提供了方便的Flexi 载体克隆系统。这是一种定向克隆技术,基于两个稀有酶切位点的限制性内切酶,SgfI和PmeI。它能够快速、高效、高保真性地在不同 Flexi 载体间转移蛋白编码区,而无需重新测序。

NanoBRET™ PPI Flexi Starter System 就以Flexi 载体为基础,提供了蛋白相互作用检测的解决方案,包括载体,检测试剂及阳性对照。这个过程很简单,就是经典的酶切连接过程,也不需要构建入门载体。由于载体本身在SgfI和PmeI酶切位点之间是一个致死基因,这使得阳性克隆的几率大大增加,但也带来载体保存的问题。我们无法复制,只能每次向厂家购买。

当然,你也可以选择另一个常规方案,利用多克隆位点(MCS)来克隆。Promega的NanoBRET™ PPI MCS Starter System提供带有多克隆位点的NanoLuc® 融合蛋白克隆载体和HaloTag® 融合蛋白载体,以及检测试剂和阳性对照。这些组分也可以单独购买。

别人怎么用?

研究人员已经利用NanoBRET™ 技术发表了不少文章。今年1月,清华大学和宾夕法尼亚大学的研究人员在研究Rabin8的蛋白构象是否起着自抑制作用时,就使用了NanoBRET™ 技术1。

Rab蛋白是Ras超家族中的一类,也是一类低分子量的GTP结合蛋白(大约20-29 kDa),它们负责调控真核细胞的囊泡运输等过程。其中,Rab8是胞吐作用的一个关键调控因子。Rabin8是一种鸟苷酸交换因子(GEF),也是Rab8的主要激活因子。

在这项研究中,研究人员构建了Rabin8重组体,在N端融合NanoLuc® 萤光素酶,C端融合HaloTag® 蛋白,这样他们就能利用BRET作为蛋白构象的指示剂。同时,他们采用突触融合蛋白-4(syntaxin-4)重组体作为阳性对照。之后在大肠杆菌中表达两个重组体,并加入NanoBRET™ Nano-Glo® 底物,测定荧光。

通过比较Rabin8和Rabin8突变体的信号,研究人员确定磷酸化作用是Rabin8激活的一个重要机制。他们证实了Rabin8是ERK1/2响应EGF信号的一个直接磷酸化作用底物。在分子水平上,ERK1/2磷酸化Rabin8减轻了它的自抑制,由此促进了Rabin8的GEF活性。这项研究确定了Rabin8激活的一种分子机制。

关于NanoBRET™ 技术的更多文献,以及详细资料和报价,请点击此处向Promega索取。(生物通 余亮)

参考文献:

1. Juanfei Wang, Jinqi Ren, Bin Wu, et al., Activation of Rab8 guanine nucleotide exchange factor Rabin8 by ERK1/2 in response to EGF signaling, PNAS, 2015 112(1):148-53.

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