PNAS:基于CRISPR的多色荧光标记系统

【字体: 时间:2015年03月02日 来源:生物通

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  在最新一期《PNAS》发表的一项研究中,来自美国麻省大学医学院和中佛罗里达大学的研究人员,设计了一种基于CRISPR的多色荧光标记系统,可特定而有区别地同时标记不同对的染色体位点。从而可让我们评估活细胞中位点之间的距离。

  

生物通报道:基因组位点的核内定位和这些位点的动力学,是了解基因表达时空调控的重要参数。伴随着核酸原位杂交引入到细胞生物学之后,分子细胞生物学领域取得了重要的进展。多年来,这种方法已经逐渐发展的更加敏感,它的重要性怎么强调都不为过。后来,也引入了其他方法,来荧光标记活细胞中的特定染色体位点,最近也开发出了其他方法。

这些较新方法中的第一种,用转录激活因子效应器(TALENs)共轭荧光蛋白,来标记活细胞中的特定染色体位点。第二种方法再利用细菌免疫集群定期穿插短回文重复(CRISPR)/CRISPR相关蛋白质9(Cas9)系统,进行真核细胞的基因编辑,在这个过程中,一直都是利用Cas9核酸酶与靶位点个性化单导向RNAs(sgRNAs),实现可编程DNA的识别和靶基因裂解。延伸阅读:Cell Rep:用CRISPR/Cas诱导基因组结构变异

除了进行基因编辑之外,CRISPR/Cas9系统也被用于序列特异性基因调控(利用核酸酶失活的Cas9,dCas9),最近有研究证明,可用转录激活因子样效应物(TALENs)以及(CRISPR)/CRISPR相关Cas9系统的修改版本,可视化活细胞中的内源性基因组位点(通过与荧光蛋白融合)。然而,由于需要双标签,用CRISPR技术解析细胞核内不同染色体间或染色体内的位点,一直都是具有挑战性的。

在最新一期《PNAS》发表的一项研究中,来自美国麻省大学医学院和中佛罗里达大学的研究人员,利用来自三种细菌直系同源物的催化失活Cas核酸内切酶(dCas9),设计了一种基于CRISPR的多色荧光标记系统,可特定而有区别地同时标记不同对的染色体位点。每对dCas9-荧光蛋白和同源单导向RNAs(sgRNAs),可有效地标记人活细胞内的几个靶位点。从而可让我们评估活细胞中位点之间的距离。

利用几对不同颜色的dCas9-sgRNAs,研究人员能够确定不同染色体上位点之间的核内距离。此外,同一染色体上两个位点之间的荧光空间分辨率是可被确定的,并与染色体物理图谱上它们之间的线性距离有关。

该系统具有许多潜在的应用,例如它是探查细胞周期进程中、表观遗传调节过程中或响应细胞刺激过程中,染色体内和染色体间结构域动态相互作用的一种有用工具。研究人员应用这种方法,绘制出每个人类染色体特有重复序列在染色体内的位置。原则上,这种方法也可用于分析核纤层相关的结构域和染色体捕获为基础的拓扑关联结构域,并允许我们对活细胞中诸如易位和癌症相关染色体破碎、重排这种事件进行可视化研究。

(生物通:王英)

生物通推荐原文摘要:
Multicolor CRISPR labeling of chromosomal loci in human cells
Abstract:The intranuclear location of genomic loci and the dynamics of these loci are important parameters for understanding the spatial and temporal regulation of gene expression. Recently it has proven possible to visualize endogenous genomic loci in live cells by the use of transcription activator-like effectors (TALEs), as well as modified versions of the bacterial immunity clustered regularly interspersed short palindromic repeat (CRISPR)/CRISPR-associated protein 9 (Cas9) system. Here we report the design of multicolor versions of CRISPR using catalytically inactive Cas9 endonuclease (dCas9) from three bacterial orthologs. Each pair of dCas9-fluorescent proteins and cognate single-guide RNAs (sgRNAs) efficiently labeled several target loci in live human cells. Using pairs of differently colored dCas9-sgRNAs, it was possible to determine the intranuclear distance between loci on different chromosomes. In addition, the fluorescence spatial resolution between two loci on the same chromosome could be determined and related to the linear distance between them on the chromosome’s physical map, thereby permitting assessment of the DNA compaction of such regions in a live cell.

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