跨组学技术在中医证型研究和中药作用机制的应用

随着2015年的自然科学基金申请日期的日益临近，广大科研工作者将开始新一轮的基金申请准备工作。锐博生物根据当前医学生物领域的热门研究方向，将陆续推出一系列的研究方案，内容涵盖《疾病相关lncRNA研究策略》、《疾病相关miRNA研究策略》、《siRNA文库高通量筛选策略》、《疾病相关Exosome研究策略》、《中医药分子水平作用机制研究策略》等，为科研工作者的课题申请提供参考，敬请关注！

中医药是一门有着几千年历史的系统生物学科。这门学科既古老又超前，既简单又复杂，她有着完全独立于当今世界的医学流派的独特理论体系和应用形式，为世界所瞩目。中医药理论体系是中华民族的宝贵财富，为中华民族的繁衍昌盛做出了巨大贡献！

现代西方生物医学，借助物理、数学、化学等学科的发展和各种先进研究工具的广泛应用，从器官水平到分子水平、从基因组到代谢组，在有形的物质层面不断加深对疾病发生、药物作用机制的认识，进一步全面扩展对生命的认知。而中医药理论着眼于天人合一的整体观大系统框架，从阴阳、五行、藏象、经络等有质无形层面，通过望闻问切四诊和八纲辩证，指导中药的组方施治。《黄帝内经》云，有诸形于内，必形于外。阳化气，阴成形。对于生命机体来说，生命的基本构造和功能皆是由基因决定，因此无论是西医理论所注重的有形层面，还是中医理论所着眼的无形层面，终究会殊途同归，统一于基因表达差异与多样性。在中医传统理论指导下，利用现代基因组、表观组、转录组、蛋白质组、代谢组、宏基因组等跨学科多组学技术，可以从基因水平揭开中医药理论神秘面纱，为中医药现代化过程中所要解决的证型诊断标准及中药配伍理论等问题提供强大动力。

本文介绍前沿的组学技术在中医证型研究和中药作用机制的应用，希望能为中医药的现代化起到抛砖引玉的作用。

一、 跨组学技术在中医证型研究的应用

1、 血清Exosome转录表达谱在中医证型标准制定的应用

背景依据
医方之祖《伤寒论》把病证归入六经，通过六经辨证来诊断疾病和遣药处方，疗效卓著，虽历经千年而不息。六经无形，却循于有形的五脏六腑，统聂于阴阳气血。脏腑之中，五脏最为重要。五脏归于五行，相生相克，彼此形成平衡协调的关系，维持着生命的健康。阴阳失衡，五行失调，遂生疾病。中医认为，血是在心气推动下循环于脉道之中以营养周身的红色液体，它内注五脏六腑，外滋四肢百骸，是维持生命的重要物质。《中藏经》借用五行理论，以心、脾、肺、肾、肝的母子关系来说明五脏在血生成上的关系。如“心生血，血为肉之母；脾生肉，肉为血之舍；肺属气，气为骨之基；肾应骨，骨为筋之本；肝系筋，筋为血之源。”因此，五脏失衡病变，也会在血液层面表现出变化。

血液成分复杂，除了包含各种血液细胞，还存在一种重要的成分—exosome(外泌体)。Exosome由各种细胞和器官所分泌，是细胞间进行远距离通信对话的载体，而其中所包含的信息分子（蛋白质、DNA、RNA、脂类等）则发挥对话功能。目前的研究已经发现，T细胞、B细胞、血小板、树突细胞、肥大细胞等血细胞及上皮细胞、肿瘤细胞等其他非血源性细胞都会分泌exosome进入血液、唾液、尿液、及乳汁等体液中，通过循环系统到达其他细胞与组织，产生远程基因表达调控作用。

Exosome中的成分虽然复杂，但是目前发现，主要是其中的miRNA、mRNA分子起作用，而随着技术的发展，exosome中另外一类重要的核酸分子—lncRNA，也被越来越多的报道。（详见《相约2015NSFC》之疾病相关外泌体RNA研究策略）。现已发现正常细胞和疾病细胞所分泌的exosome 所包含的核酸分子存在差异，这些差异，可依据exosome核酸分子中具有的器官特异性，对证型进行六经脏腑归类；依据核酸分子表达谱的高低有无，可进行阴阳虚实寒热表里的判别。Exosome的核酸分子，可以作为疾病诊断的分子标志物。

技术路径

补充说明：
(1) exosome 中miRNA的筛选与功能研究，详见《相约2015NSFC》之疾病相关外泌体RNA研究策略；
(2) lncRNA相比于mRNA，具有更高的组织特异性和疾病特异性，但是有赖于基础数据的积累，需要在组织水平先建立正常和疾病的lncRNA表达谱作为基础数据，作为判别血清exosome中lncrna来源的依据；

2、 表观基因组学技术在中医体质分型及证型标准建立的应用

背景依据：
体质是先天遗传和后天生长发育共同作用所表现出的相对稳定的生理特性。中医体质分类与判定在中医上都有明确的标准，但是体质的遗传特性研究进展比较缓慢，因此没有合适的能够用于体质分型的分子遗传标记。

表观遗传在基因组表达中起到重要的调控作用，与很多复杂疾病发生有重要关系，具有网络性和可逆性。表观遗传并不是改变基因组DNA序列信息，其变化是可以逆转的，并非永久性，这也就为从表观遗传层面防治复杂性疾病提供了可能。在表观基因组层面建立中医体质分型标准，有利于预测不同体质的易感疾病，提供合理的用药指导。同时，表观遗传学也是复杂性疾病证候本质的重要内容，对表观遗传的调控是中医调治复杂性疾病证候的重要环节。

目前已经有报道，血液样本DNA 的甲基化修饰标记可以作为肿瘤等复杂基因诊断的分子标志，以此为据，血液样本DNA的甲基化修饰图谱也可用于中医体质及证型标准的建立。

技术路径

二、 跨组学技术在中药作用机制的应用

背景依据：
中药成分复杂，作用层次不明，靶点众多，是目前制约中药作用机制研究的瓶颈所在。复杂成分简单化，作用靶点网络化层次化，应该是阐明中药作用机制的新思路。按照西方传统的还原法，研究中药作用机制，需要对中药成分逐个提纯后研究其作用位点，这种中药西做的思路并不能真正代表中药客观作用效果。因为中药在炮制和煎煮过程都会发生化学反应产生新的化学分子，这些新的分子也应该是药物成分之一，而且中药中的成分并不只作用于一个层面，可能同时对多个层面产生药效。有鉴于此，我们建议逆向推导，从影响基因表达的因素入手，通过研究转录调控不同层面中中药成分功能，从转录差异入手来发现相关的中药有效成分，分析中药发挥药效的机理。具体到实验方案，我们建议利用中药血清/血浆药理学所提取的成分，作用于培养的细胞模型或者动物模型，研究药物成分对细胞中基因表达不同调控层面的分子网络作用。

补充说明：
（1） DNA甲基化修饰及组蛋白修饰对基因的转录调控起到重要的作用，两者同属转录前调控层面。中药成分如果作用于DNA甲基化修饰酶和组蛋白修饰酶，均对基因的转录表达起到重要作用，结合后续的转录组数据，可以构建表观组-转录组分子网络。
（2） Small RNA和lncRNA都是重要的基因表达调控分子，占据基因组的大部分，对编码蛋白基因的表达和功能起着重要的调控作用。结合蛋白质组学的数据，可以分析非编码RNA对下游基因的调控重要，构建ncRNA-蛋白质分子网络。
（3） 清华大学李梢教授提出症候生物网络--生物分子网络--药物网络的研究模型，非常符合中医药本身的特点，值得推广和应用。基于这个模型，可以通过结合药物分子网络的数据来推断生物分子网络的作用位点，有利于缩小筛选范围。后续在靶点验证上，建议通过siRNA文库进行高通量筛选。
（4） 构建分子网络后，需要在细胞水平和动物水平进行验证，基于中药有上千年的临床应用基础，可以结合临床样本进行检测，充分利用好中医药的这一优势，有利于获得最为真实的实验数据。

后记：

中医药系统的复杂性，一直制约着这个学科的发展。随着对外的不断开放，未来中药企业将面临越来越大的市场竞争。新药审批过程中，将对药物作用机制和安全性评价的研究提出更高要求。不加强中医药的基础研究和创新性研发，中医药行业发展之路将越走越窄。

当前各种组学技术、生物信息学技术及基因功能研究技术的发展和应用，有利于在宏观系统生物学层面和微观分子层面加速中医药研究的进展，需要本领域的研究人员把握这难得的机遇。中医药研究是一个巨大的系统工程，涉及面广，研究投入巨大，研究周期长，但是对于现代医学发展与民族文化传承都具有深远意义。我们希望，未来能够有越来越多国家层面的顶层设计，组织中医药学术界和企业界的中坚科研力量，优化社会资源的配置，充分利用各项组学技术和高通量筛选技术及先进的基因功能研究技术，建立症候生物网络--生物分子网络--药物网络三个网络的基础数据库，并通过大数据技术进行整合分析。这三个分子网络的建成，将对科学阐明中医药作用机制和推动本学科的产业发展起到极为关键的作用。