跨组学技术应用于中医研究的参考案例

随着2015年的自然科学基金申请日期的日益临近，广大科研工作者将开始新一轮的基金申请准备工作。锐博生物根据当前医学生物领域的热门研究方向，将陆续推出一系列的研究方案，内容涵盖《疾病相关lncRNA研究策略》、《疾病相关miRNA研究策略》、《siRNA文库高通量筛选策略》、《疾病相关Exosome研究策略》、《中医药分子水平作用机制研究策略》等，为科研工作者的课题申请提供参考，敬请关注！

案例1：全基因组分析同系统生物学方法结合，鉴定类风湿性关节炎热症和寒症

类风湿性关节炎（Rheumatoid arthritis，RA）是一种多相疾病，中医理论基于RA的临床表现将其划分为热症和寒症。本项研究中，研究者从21名冷症RA病人和12名热症RA病人的外周血中提取出CD4+ T细胞，并使用表达谱芯片鉴定了这些细胞中的23，232个转录本，发现在冷症RA病人体内有4个转录本表达比热症高，21个转录本比热症RA低，蛋白互作网络分析发现4个高关联区域，这些子网络区域中最相关的功能和通路与小G蛋白通路、脂肪酸氧化还原和T细胞增殖有关。

热症和冷症RA之间转录本表达差异统计

 
冷症和寒症RA蛋白互作网络

由高关联区域组成的子网络及节点功能

子网络生物分类

相关文献：Chen G， Lu C， Zha Q， et al. A network-based analysis of traditional Chinese medicine cold and hot patterns in rheumatoid arthritis[J]. Complementary Therapies in Medicine, 2012, 20(1): 23-30.

案例2：不同疾病所产生的相同证候及相同疾病所引发的不同疾病之间的分子机制

本项研究中，研究者使用生物芯片，对乙型肝炎（chronic hepatitis B，CHB）和肝硬化（liver cirrhosis，LC）中的肝胆湿热症（liver-gallbladder dampness-heat syndrome，LGDHS）和肝郁脾虚症（liver depression and spleen deficiency syndrome，LDSDS）两种证候样本进行检测。结果表明CHB和LC样本之间的差异来源于G蛋白耦联受体信号通路相关基因表达差异，LGDHS和LDSDS之间的差异则来源于该通路基因差异共表达。在LGDHS中，GPER、PTHR1、GPR173和SSTR1有共表达现象，而在LGDHS则不存在。CHB和LC都可以根据差异共表达被区分为不同的证候，而同一种证候也可基于基因表达差异被区分为CHB或LC两种不同疾病。这些研究或许能为中药开发及中药治疗提供帮助。

 
LGDHS和LDSDS中98个基因表达差异热图

 
不同疾病和不同证候中G蛋白耦联受体信号通路中的疾病关系

相关文献：Guo Z, Yu S, Guan Y, et al. Molecular mechanisms of same TCM syndrome for different diseases and different TCM syndrome for same disease in chronic hepatitis B and liver cirrhosis[J]. Evidence-Based Complementary and Alternative Medicine, 2012, 2012.

案例3：胰腺癌发生过程中不同证的分子机制

本项研究中，作者构造出湿热和脾虚两种证候的胰腺癌细胞和动物模型，并分析了这两种证候中CCR5和CXCR4蛋白和CCR5/CCL5/CCL4/CCL3和CXCR4/SDF-1基因mRNA的转录水平，同时用ELISA检测了CXCR4和CCR5蛋白配体SDF-1、CCL4、CCL5、和CCL3的水平。结果表明，湿热证候组中，CCR5蛋白阳性率最低，CCL5和CCL4水平最低，这一组胰腺癌发生速度也最低。这表明证候差异可能会影响胰腺癌发生，证候也可能会成为胰腺癌一个预后指标。

 
三个组别胰腺肿瘤生长速度对比

 
不同组别的CCR5和CXCR4阳性率

不同组别CCR5 mRNA RT-qPCR及WB结果

 
ELISA结果

相关文献：Dai H Y, Wang P, Feng L Y, et al. The molecular mechanisms of traditional Chinese medicine ZHENG syndromes on pancreatic tumor growth[J]. Integrative cancer therapies, 2010.

案例4：中草药miRNA直接靶向作用于数类甲型流感病毒

研究者通过miRNA测序，确认microRNA2911能在金银花煎剂中选择性地富集，且小鼠饮用金银花煎剂后，miR-2911能被递送进入血浆和肺部组织中。之后，他们证实microRNA2911可通过靶向作用于PB2 和NS1这两个流感病毒复制必需的基因，抑制多种流感病毒；给小鼠饮用金银花汤剂，可预防其感染IAV，并降低小鼠感染H5N1病毒后的死亡率，而且人工合成的microRNA2911与金银花煎剂中的内源性microRNA2911都能有效保护动物免受病毒感染，这种保护作用依赖于microRNA2911在PB2或NS1基因mRNA上的结合位点。最后，microRNA2911还能有效抑制流感病毒 H5N1 和 H7N9的复制，预示其具广谱抗甲流效果。

 
金银花和金银花煎剂中miRNA水平（测序reads数）

 
小鼠服用带绿色荧光标记的MIR2911，3h后肺部出现绿色荧光

 
荧光素酶报告载体验证MIR2911靶向作用于多种甲流病毒

MIR2911抗甲流病毒动物实验结果

相关文献：Zhou Z， Li X， Liu J， et al. Honeysuckle-encoded atypical microRNA2911 directly targets influenza A viruses[J]. Cell research， 2014.

案例5：小柴胡汤通过影响数个mRNA和蛋白的转录和表达修复半乳糖胺诱发肝损伤

小柴胡汤在临床上常用于治疗慢性肝炎、肝硬化等肝部疾病，本文介绍了小柴胡汤在小鼠体内修复半乳糖胺诱发肝损伤的机制。实验中，给小鼠喂食小柴胡汤，利用qPCR及Western Blot检测，确认小柴胡汤会显著抑制血清中IL-6和TNF-α水平，进一步抑制FasmRNA，FasLmRNA转录和Bax蛋白表达，同时提升Bcl-2 mRNA转录，从而实现肝修复功能。

 
qPRC检测相关基因mRNA丰度变化

 
Bax蛋白表达量变化

案例6：原发性肝癌肝肾阴虚证患者外周血单个核细胞差异基因筛选

研究者选取肝虚肾阴虚证与非肝肾阴虚证肝癌患者为研究对象，选用全基因组表达谱芯片，对二者外周血单个核细胞进行检测。共获得差异表达基因615个，GO注释后，有278个具有显著性功能差异，主要涉及跨膜转运、细胞周期调控、诱导凋亡等功能。KEGG标记后，上调差异基因参与显著性信号通路16项，下调差异基因参与显著性信号转导通路10项，包括抗原加工与递呈转导通路、代谢途径转导通路、细胞周期转导通路、蛋白质输出转导通路等。用差异基因构建共表达网路图，筛选出3个显著性差异基因（SEC62、CCNB1、BIRC3），并在更多样本中得到验证。

差异基因GO-MAP

差异基因构建肝肾阴虚证共表达网路图

相关文献：翁莉, 杜鹃, 何文婷, 等. 原发性肝癌肝肾阴虚证患者外周血单个核细胞的特征性差异基因[J]. 中西医结合学报, 2012, 10(4): 406-415.

案例7：亚健康状态肾阳虚证基因差异表达研究

选取亚健康状态肾阳虚证患者作为研究对象，使用生物芯片对正常组和实验组全基因组进行检测，共获得差异表达基因75条。其中，表达水平上调（Ratio值大于2）的有22条，表达水平下调（Ratio值小于0.5）的有53条，亚健康状态肾阳虚证组和正常对照组间存在差异基因表达特征图谱。

肾阳虚证差异表达基因

肾阳虚证组与正常对照组比较差异基因聚类分析示意图

肾阳虚证差异基因功能分类示意图

相关文献：魏敏, 赵晓山, 孙晓敏, 等. 亚健康状态肾阳虚证基因差异表达研究[J]. 南方医科大学学报, 2011, 31(2): 248-251.

案例8：使用新一代测序技术确认舌苔微生物组

舌诊是中医中一种独特的诊断方法，舌诊（尤其是舌苔）变化与机体生理、病理状态，以及药物的治疗效应、疾病和证候转归及预后等密切相关，在疾病的治疗过程中，常常可见舌质和舌苔随着疾病病情的变化发生动态性转变，因此“舌诊”必然具有内在的生理和病理基础，并且这种“基础”具有整体性和功能性特点，即舌质和舌苔的变化是机体整体机能变化的系统性综合反映。

本项研究中，研究者以9位寒证型慢性萎缩性胃炎病人和10位热证型慢性萎缩胃炎病人为研究对象，这些病人都表现为典型的白腻苔或黄苔，使用新一代测序技术，通过16s rRNA测序，分别从寒证和热证病人舌苔中鉴定出123个和258个分类单元，并命名为寒证微生物群和热证微生物群。同时，研究者也完成了两个微生物群与寒证和热证的不平衡网络构建。结果表明，舌苔微生物群或许可以成为一个整体性诊断生物指标。

本文所使用的16s测序流程