单细胞表观遗传学研究指南(上)

【字体: 时间:2015年02月09日 来源:生物通

编辑推荐:

  The Scientist最近撰文详细介绍了单细胞表观遗传学研究中的一些关键技术。这些技术可以帮助我们在单个细胞中检测DNA、组蛋白和染色质水平上的表观遗传学修饰。

生物通报道:随着测序成本的直线下降,解读一个生物的基因组正在逐渐成为研究者们的日常工作。然而,并不是所有细胞都能够达到测序要求,测序一般需要几千到一百万细胞。举例来说,如果你研究的是早期胚胎发育,那么可用的细胞数量就很少。

在这种情况下每一个细胞都很宝贵,新加坡A*STAR分子与细胞生物学研究院的Daniel Messerschmidt说。为了研究早期胚胎中的表观遗传学修饰,Messerschmidt及其同事开发了一个能够在单细胞中分析DNA甲基化的新技术。这项发表在Science杂志上的成果,使Messerschmidt成为了单细胞表观遗传学领域的先行者。(原文:Single-cell DNA-methylation analysis reveals epigenetic chimerism in preimplantation embryos

除了研究稀少细胞中的基因表达,单细胞表观遗传学检测技术还有着很大的应用空间,比如说可以用来研究细胞异质性很大的肿瘤。发育早期的表观遗传学错误能够影响终生,很可能引发疾病。另外,健康组织中也存在着表观遗传学多样性。“以往的生物学教条是,我们从父母继承到的基因组在所有细胞里是始终如一的,”单细胞基因组学专家,Leuven大学副教授Thierry Voet说,但现在这一观点已经被颠覆。

The Scientist最近撰文详细介绍了单细胞表观遗传学研究中的一些关键技术。这些技术可以帮助我们在单个细胞中检测DNA、组蛋白和染色质水平上的表观遗传学修饰。

分离单细胞

在进行单细胞表观遗传学分析之前,你需要先确定自己拿到了正确的细胞或细胞类型。

如果你想要的细胞已经处于悬浮状态(比如循环肿瘤细胞),而且含量相对比较丰富,那么流式细胞分析将是你的理想选择。如果你的样本是实体组织,那么可以用酶分解掉胶原和其他细胞外蛋白。不过酶学消化对细胞影响较大,甚至可能改变基因转录情况,Voet提醒道。在把组织细胞制成悬液之后,我们就可以通过特异性的荧光标签分离出自己想要的细胞。进一步深入单细胞是比较棘手的一步,可能需要用到微流体设备,尤其是在细胞量较少的时候。

适用于任何流式细胞实验室,Attune® NxT 声波聚焦流式细胞仪,索取免费技术资料>> >>

将细胞分散到悬液中,会失去它们在组织里的位置信息。如果你想要了解单个细胞的邻居和环境线索,你就需要使用激光捕获显微切割技术。这种技术可以通过扫描组织切片,定位你想要研究的细胞,并将其提取出来。操作者需要非常小心,不要切到目的细胞流失含有RNA的细胞质,或者切掉部分细胞核,Voet指出。

数量最为稀少的细胞只能用毛细管等器具手动获取。分离到细胞之后,我们就可以进行表观遗传学分析了。现有技术一次只能进行一种类型的单细胞表观遗传学分析,你需要决定自己研究的是DNA、组蛋白还是染色质水平上的标签。

甲基化标签

DNA的胞嘧啶甲基化是一种经典的表观遗传学标签,这种标签通常意味着被沉默的基因组区域。之前人们一直在用重亚硫酸盐测序来进行甲基化分析,这是一种相当严酷的化学方法,主要是把所有未甲基化的胞嘧啶转变为尿嘧啶。经过PCR富集,这些改变用二代测序很容易检测出来。近来,一些研究团队将这一技术发展到了单细胞水平。


Babraham研究所的Gavin KelseyWolf Reik等人,开发了能分析单细胞中所有DNA甲基化的方法。为此,他们需要克服重亚硫酸盐处理造成的遗传物质损失。研究人员并没有像通常那样先片段化DNA,而是对单个细胞的裂解物进行重亚硫酸盐转化。然后他们对得到的DNA片段进行五次扩增以增加拷贝数。 “我们得到了很理想的单细胞甲基化图谱,” Kelsey说。(相关报道:Nature Methods发表单细胞重亚硫酸盐测序技术

这个方案需要不少手动操作,但并不比常规重亚硫酸盐测序难多少。操作者们需要注意的主要问题是,每一步操作都有可能引入错误。Kelsey建议大家运行大量阴性对照,当你遇到问题的时候,就能很方便的找出问题所在。

Messerschmidt开发的检测法也是以重亚硫酸盐测序为基础的,不过检测的是特定位点的甲基化。他们通过限制性内切酶消化,来分离含有目的基因的片段,去除其他无关DNA。这是因为,重亚硫酸盐测序可能降解你想要分析的DNA,而这种方法能够避开这个问题生成更准确的结果,但是一次只能分析少数几个基因。“从某种意义上看,这其实比较像是一种诊断分析,”Messerschmidt说。Messerschmidt的方法可以更快得到结果,可以用来进行IVF胚胎筛选。当然,这一方案也可以用于其他数量稀少的细胞,比如小肠隐窝中的成体干细胞。

在使用这一方法时,裂解细胞需要非常小心,确保“不要都弄到管壁上”,Messerschmidt提醒道。“否则,液体快速蒸发之后你的DNA就粘在那里没用了。我们应当尽量保证DNA的良好状态,避免破坏DNA链。因为如果断裂发生在你想要研究的位置上,就会被解读成未甲基化的胞嘧啶而产生错误的结果。”Messerschmidt等人最近会在Nature Protocols上发表一篇文章,详细阐述这个方案的细节之处。

日本九州大学的Hiroyuki Sasaki及其同事开发了直接成像甲基化标签的技术,甲基化特异性原位杂交(MeFISH)。MeFISH用荧光探针结合甲基化的胞嘧啶,很容易就能在显微镜下看到这些标签,能从几百个细胞快速得到分析数据。虽然这个技术一次只能检测少量细胞,但它能够区分5-甲基胞嘧啶(5mC)和5-羟甲基胞嘧啶(5hmC)。上文提到的重亚硫酸盐测序法都不能区分这两种表观遗传学修饰。(原文:Sequence-specific microscopic visualization of DNA methylation status at satellite repeats in individual cell nuclei and chromosomes. Nucleic Acids Res.

(下接:组蛋白和染色质水平上的单细胞表观遗传学分析

 

我来说两句
0  条评论    0 人次参与
登录 注册发布
最新评论刷新
查看更多评论 > >

订阅生物通快讯

订阅快讯:

最新文章

限时促销

会展信息

关注订阅号/掌握最新资讯

生物通首页 | 今日动态 | 生物通商城 | 人才市场 | 核心刊物 | 特价专栏 | 仪器龙虎榜

版权所有 生物通

Copyright© eBiotrade.com, All Rights Reserved

联系信箱:

粤ICP备09063491号