BioTechniques:从细菌和酵母中提取gDNA的简便方法[创新技巧]

【字体: 时间:2015年03月12日 来源:新华网

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  从微生物中提取基因组DNA,人们多采用异硫氰酸胍进行裂解,不过对于有些细菌而言,仍需要繁琐的预处理。加拿大舍布鲁克大学(Université de Sherbrooke)的研究人员开发出一种快速而经济的gDNA提取方法,适用于各种浓度的细菌和酵母。这种新方法发表在《BioTechniques》3月刊上。

从微生物中提取基因组DNA,人们多采用异硫氰酸胍进行裂解,不过对于有些细菌而言,仍需要繁琐的预处理。加拿大舍布鲁克大学(Université de Sherbrooke)的研究人员开发出一种快速而经济的gDNA提取方法,适用于各种浓度的细菌和酵母。这种新方法发表在《BioTechniques》3月刊上。

为了加速微生物的检测和分析,许多分子生物学技术都经过了优化,如PCR、质谱和测序。然而,DNA提取方法却始终未见大的进展。异硫氰酸胍处理和硅胶柱的方法能够从革兰氏阴性菌中很好地提取DNA,但革兰氏阳性菌或抗酸的细菌和酵母仍需要酶学或机械预处理。对于血液或尿液这种存在不同类型微生物的样品而言,这很麻烦。

人们也尝试了各种策略来增强异硫氰酸胍对微生物的裂解,包括机械法、酶学或化学处理。机械处理也许是最常用的方法,但可能将gDNA剪切成小的片段,限制PCR扩增子的量。对于含有不同类型微生物的样品,这个问题就变得更加复杂,因为不同微生物可能需要不同的微珠和处理时间。酶学和化学裂解通常也是因微生物而异,往往更耗时。

在这项研究中,Laurie Vingataramin 和Eric H. Frost采用了一种称为EtNa的新方法。它通过加热乙醇碱性溶液而释放出细菌和酵母中的单链DNA,关键是不同微生物的提取效率相似。当微生物的身份未知,或提取不得忽视或偏向特定微生物时,这种方法就很有用。

之前,Frost与同事开发出原型方法,提取出金黄色葡萄球菌的DNA。此次,Vingataramin和Frost对EtNa方法进行了改良。它的具体过程是:在61%的乙醇、200 mM NaOH、2.25 mM EDTA溶液中重悬细菌沉淀,并在80°C下加热悬液10分钟。释放出的单链DNA(ssDNA)随后沉淀在微量离心管中,重悬后用于PCR(EtNa crude)。或者,将加热后的混合物上样到QiaAmp DNA Mini Kit的纯化柱中,以纯化gDNA(EtNa pure)。

研究人员以多种细菌和酵母为样本,比较了EtNa方法及其他常用方法,包括QIAGEN的QiaAmp DNA Mini Kit和Life Technologies的ChargeSwitch gDNA Mini Kit。他们使用了100 μl样本,其中包含107 rRNA当量的白色念珠菌,或108 rRNA当量的大肠杆菌或表皮葡萄球菌。结果表明,所有方法都成功提取了细菌DNA,但只有EtNa和LiOAc-SDS成功提取出酵母中的gDNA。

作者认为,他们开发出一种快速、经济而可靠的裂解酵母和细菌的方法。EtNa试剂可用于临床诊断或生物医学研究中,在25分钟内处理各种生物样品。通过这种方法获得的ssDNA可直接使用,或经过硅胶柱进一步纯化。(生物通 薄荷)

原文检索:

A single protocol for extraction of gDNA from bacteria and yeast
 
Laurie Vingataramin and Eric H. Frost
BioTechniques, Vol. 58, No. 3, March 2015, pp. 120–125

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