探索染色质动力学的新工具

如今，几乎每位研究人员都或多或少地知道生成诱导多能干细胞（iPSC）的配方。拿出体细胞，加入四种转录因子，等待几个星期，搞定！

不过，这其中到底发生了什么，却是一个谜，人们想了解却还未了解。显然，这涉及到表观遗传学：从成纤维细胞转变成iPSC，意味着那些过去关闭的基因必须再次启动。其他基因，比如细胞分化的标志，则必须调低。

西奈山医院Lunenfeld-Tanenbaum研究所的资深科学家Andras Nagy谈道：“每个细胞的基因组都几乎是相同的。表观基因组指定哪些基因表达，哪些蛋白合成。”

这些变化反映在基因组规模的多个变量上，包括DNA甲基化、染色质修饰、长链非编码RNA的表达及其他。它们被统称为“染色质动力学（chromatin dynamics）”，对细胞中的一切都很关键。

染色质动力学研究基本上是通过基因组规模的染色质免疫沉淀（ChIP-Seq）或DNA甲基化分析（亚硫酸氢盐测序），在一段时间内收集表观基因组的数据集。理论上虽然很简单，但这些研究仍然是浩大的工程。

比如Project Grandiose，去年十二月在Nature和Nature Communications上发表五篇文章，从客观角度深入分析了细胞重编程。这项研究正是由Lunenfeld-Tanenbaum研究所牵头的。

据Nagy介绍，Project Grandiose（宏大计划）这个名字正反映了他们的努力程度。五十名科学家耗时四年，每天研究数千万个细胞，记录从成纤维细胞到iPS细胞的过程中伴随的转录、蛋白质组和表观基因组的变化。在表观基因组研究中，他们通过亚硫酸氢盐测序了解DNA甲基化，通过RNA-Seq监控非编码RNA的转录，通过ChIP-Seq研究组蛋白修饰。

这些文章描述了一种之前不曾知晓的细胞状态“F-class”1。在表观基因组水平。从F-class到iPS细胞的转化是与DNA甲基化和组蛋白修饰的整体变化相关联的，最初抑制性的染色质标记丢失，接着DNA甲基化发生改变，这似乎锁定了细胞的新状态。“这些细胞失去并忘记了它们的身份，并寻找如何发育成新细胞的线索，”Nagy说。

不断涌现的技术

尽管ChIP不是一项新的技术，但研究人员仍在不断完善它。经过ChIP验证的新抗体仍在持续开发中。默克密理博也在二月推出了PureGenome Low Input NGS Library Construction Kit。据介绍，它可以对低至50 pg ChIP纯化的DNA进行测序，这相当于1000个细胞。相比之下，它的另一个产品Magna ChIP-Seq™ ChIP and NGS Library Preparation Kit则需要1 ng DNA。

不过，Active Motif产品经理Kyle Hondorp指出，ChIP-Seq只是研究染色质动力学的众多方法中的一种。其他一些方法则揭示了基因组的结构，包括3C（染色体构象捕获）、5C（染色体构象捕获碳拷贝）和ChIA-PET。它们捕获那些通过分子内相互作用而聚在一起的DNA区域。通过测序所产生的连接点，研究人员开始呈现染色质的高级结构，以及它如何随时间而改变。

斯坦福大学医学院的William Greenleaf在2013年介绍了另一种有用的方法2。这种名为ATAC-Seq的分析利用Tn5转座酶对常染色质的偏好来鉴定转录活跃的基因组区域。Greenleaf的研究小组利用这种方法鉴定了一名个体T细胞内IL-2位点的染色质状态。

ChIRP（chromatin isolation by RNA purification）、CHART（capture hybridization analysis of RNA targets）和RAP（RNA antisense purification）等方法则详细介绍了染色质与非编码RNA之间的相互作用。默克密理博最近推出了一个开展ChIRP的试剂盒，称为EZ-Magna ChIRP RNA Interactome Kit，让用户能够分离与特定非编码RNA相关联的基因组DNA和/或蛋白质。

对于那些希望了解蛋白质复合物分布的研究人员而言，Active Motif如今提供一种RIME（rapid immunoprecipitation mass spectrometry of endogenous proteins）服务。据Hondorp介绍，RIME与ChIP类似，也利用特异蛋白的抗体来分离基因组DNA。但与传统的ChIP操作不同，RIME保留蛋白质，并通过质谱鉴定。“这样能够了解哪些蛋白质也位于染色质的相同区域，”她说。

事实上，研究人员从来都不缺探索染色质动力学的技术。Nagy认为，困难在于分析。具体是指获得不同的组学参数的整体视图，因为它们为应对环境和发育线索而起起伏伏。Nagy表示这方面的工具欠缺，但正在开发中。

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（作者：Jeffrey M. Perkel/生物通编译）

参考文献：

[1] Tonge, PD, et al., “Divergent reprogramming routes lead to alternative stem-cell states,” Nature, 516:192–7, 2014. [PubMed ID: 25503232]

[2] Buenrostro, JD, et al., “Transposition of native chromatin for fast and sensitive epigenomic profiling of open chromatin, DNA-binding proteins and nucleosome position,” Nat Methods, 10:1213-8, 2013. [PubMed ID: 24097267]