诺奖得主最新研究发现RNAi通路重要组分

　　

近期，Cell报道了06年诺贝尔生理及医学奖得主Carig. C. Mello课题组关于线虫体内RNAi信号放大过程的最新研究成果。在这项研究中，研究者鉴定出一种保守的核酸内切酶RDE-8，并对这种酶在整个RNAi过程中的作用进行了探索。

在线虫中，外源dsRNA（exo-RNAi）通过两步Ago反馈产生RNAi效应，初级Ago蛋白RDE-1装载Dicer切割产生的22nt长度初级siRNA（22G-RNA），RDE-1/siRNA复合体识别靶点，诱导RdRP（RNA-dependent RNA polymerase）合成次siRNA，次级siRNA被装载进入一类线虫特有的Ago蛋白（WAGOs），进一步在不同通路中发挥沉默效应。另外，线虫中还存在一种ERI（enhanced RNAi）通路，该通路也是一种两步Ago通路，由一个名叫RRF-3的RdRP和DCR-1酶产生26G-RNA，26G-RNA被装载进入Ago蛋白ERGO-1，诱导RRF-1和EGO-1等RdRP催化22G-RNA合成，所合成的22G-RNA再与胞质WAGO结合，产生RNAi效应。

研究者首先对RNAi缺陷型（Rde）线虫进行了遗传分析，筛选出一个关键基因ZC477.5，确认该基因就是之前命名的rde-8。该基因编码一个339个氨基酸组成的蛋白质，具有明显的核酸内切酶活性，在体外环境可以将单链RNA降解为不同大小的片段。研究人员认为，该基因是RNAi通路中所必需的一种核糖核酸酶。

 
测序表明，WT型rde-8在靶向sel-1基因的初级 siRNA存在时，会催化产生更多次级siRNA，这些siRNA被比对到sel-1基因的反义链上，表明它们是以sel-1的mRNA为模板合成的

为了探索RDE-8在RNAi通路中的具体作用，研究人员将rde-8突变型和野生型细胞株暴露于靶向sel-1基因的dsRNA中，Northern blot及测序结果表明，在rde-8突变型细胞内，两种不同来源的small RNA：WAGO 22G-RNAs和ERGO-1 26G-RNA都出现了明显下降，在另一项分析中，RDE-8缺陷在造成22G-RNA减少的同时，也会引起RdRP活性明显下降；通过免疫共沉淀分析，研究人员发现RDE-8会与多种蛋白互作，定位于线虫性别因子（P-Granule），不过，免疫共沉淀并没有发现RDE-8与RdRP直接互作。

研究人员进一步将线虫暴露于靶向sel-1的dsRNA中，对GFP::RDE-8进行RIP-qPCR实验，结果发现，在野生型GFP::RDE-8实验中，没有捕获到更多sel-1 转录本，而RDE-8突变型GFP::RDE-8（D76N）实验中，则捕获到了更多sel-1转录本，这说明GFP::RDE-8与sel-1转录本结合可能是一个瞬时过程，并直接将sel-1转录本进行切割。RNA pull down及共免疫沉淀实验表明，该过程需要另一个酶RDE-1，RDE-1会装载Dicer切割产生的初级 siRNA，再与RDE-8组成复合体，在RDE-8互作因子RDE-3促进下，引导RDE-8结合到靶点mRNA上，并进一步对mRNA进行切割。通过3’RACE实验确认，被切割产生的mRNA的3’端会被尿苷化，所产生的3’尿苷化mRNA片段会作为模板，被其他RdRP所识别，并进一步生成次级siRNA，次级siRNA又会同WAGO互作，最终产生RNAi效果。

 
将线虫暴露于靶向sel-1的dsRNA中，对GFP::RDE-8（+）及GFP::RDE-8（D76N）突变进行RIP-qPCR实验。结果表明，GFP::RDE-8（D76N）由于缺乏核酸内切酶酶活性，在RDE-3存在时，可以较长时间结合于sel-1基因转录本上，但野生型GFP::RDE-8（WT）由于只是瞬时结合于sel-1转录本，且会很快切割转录本，所以检测不到其所结合的RNA片段

 
本文所发现的线虫中RNAi放大通路示意图

总结起来，本项研究所鉴定出的RDE-8蛋白作为一种核酸内切酶，依赖于exo-RNAi 通路中RDE-1/初级siRNA组成复合体，在互作因子RDE-3促进下，与靶点mRNA结合，并对其进行切割，产生3’尿苷化修饰的mRNA片段（在ERI通路中，RDE-8与mRNA的结合及后续切割依赖于ERGO-1/初级 siRNA复合体）。该片段作为模板，在RdRP催化下，产生次级siRNA，次级siRNA与WAGO进一步互作，最终产生RNAi效应。RDE-8作为一种核酸内切酶，在RdRP上游发挥作用，将初级 siRNA与次级siRNA连接起来，是RNAi放大通路中及其重要的一个组分。RDE-8的发现，是RNAi机制研究的重大进展，它会帮助研究者更好地理解RNAi的过程，从而更好地利用此通路。

附：RNAi经典机制

目前关于基因沉默的理论认为，转录后水平的基因沉默，主要包括起始阶段、效应阶段和倍增阶段。

1、 起始阶段
外源性导入或由转基因、转座子、病毒感染等多种方式引入dsRNA， 在细胞内被Dicer特异性识别切割成21~23nt长度的带有3′端单链尾巴及磷酸化的5′端的短链dsRNA，即siRNA；
2、 效应阶段
siRNA与含有Ago蛋白的复合物结合形成RNA诱导沉默复合体（RNA-induced silencing complex，RISC），在ATP供能情况下，激活的RISC将siRNA双链分开，Ago负责催化siRNA反义链寻找互补的mRNA链，在距离siRNA 3'端12个碱基的位置将mRNA切断降解，从而阻止靶基因表达，使基因沉默；
3、 倍增阶段
siRNA在RdRP的作用下，以mRNA为模板，siRNA为引物，扩增产生足够数量的dsRNA，作为底物提供给Dicer酶，产生更多的siRNA，可再次形成RISC，并继续降解mRNA，从而产生级联放大效应。如此反复倍增，使RNAi的作用进一步放大。因此少量的siRNA就可以产生高效的基因沉默效果。

 
RNAi通路示意图

相关文献：Tsai H Y, Chen C C G, Conte D, et al. A Ribonuclease Coordinates siRNA Amplification and mRNA Cleavage during RNAi[J]. Cell, 2015, 160(3): 407-419.