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糖芯片分析实验指导

【字体: www.ebiotrade.com 时间:2016年8月2日 来源:生物通

摘要:

  经过多年的探索,科学家们已经掌握了不少糖体分子的基本生物学特征,但是比较于DNA和蛋白,我们对于这些分子的了解还远远不够,然而由于糖体结构复杂,要想构建出这种分子非常困难,而且与DNA不同,糖体几乎是不可能克隆和扩增的,因此数量也是有限。

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生物通报道:细胞表面的由脂质和蛋白组成的糖体分子蕴藏着许多奥秘,决定了细胞如何发育,如何相互作用以及沟通。细菌和病毒也就是粘附在这些线性或带分枝寡糖(glycan)上感染细胞的,免疫系统要进行反击,也需要首先学会识别微生物上的糖壳,展开先天和后天的防御。

经过多年的探索,科学家们已经掌握了不少糖体分子的基本生物学特征,但是比较于DNA和蛋白,我们对于这些分子的了解还远远不够,然而由于糖体结构复杂,要想构建出这种分子非常困难,而且与DNA不同,糖体几乎是不可能克隆和扩增的,因此数量也是有限。

近年来一种用于分析遗传物质的新技术被证明适用于糖生物学,这就是芯片技术。第一个糖芯片诞生于2002年,也就是在芯片技术问世后,用于研究基因表达后的第7个年头。

糖芯片由少量多种类的天然或合成的低聚糖组成,研究人员利用这种芯片能识别结合在糖上的蛋白,细胞和微生物。由于芯片制作只需要极少量的糖分子,因此这种技术得以首次能进行蛋白糖亲和性的广泛筛选。

目前有十几个实验室构建自己的糖芯片,随着更多的糖分子被分离和合成出来,这些芯片将会不断完善。目前制造生产最大及最多糖芯片的是一个国际性的研究协会:功能糖组学协会(Consortium for Functional Glycomics,CFG,生物通译),以及英国伦敦帝国学院的糖科学实验室,其它一些实验室则主要是针对自己的实验项目进行小规模的制作。

“在这一点上我认为没有什么单个平台的赢家”美国国家癌症研究所化学糖生物学组组长Jeffrey Gildersleeve说。

由于RNA测序价格下降,DNA芯片已不再像以前那样受到瞩目,但糖芯片的未来却被看好,“我认为未来五年里,(糖芯片)就会开始商业化,进入工业应用和临床应用领域,”埃默里大学医学院功能糖组学国家中心(NCFG,生物通译)主任Richard Cummings说。

糖芯片制备原理

糖芯片的制备原理与基因芯片,蛋白芯片相似,是将多种微量的糖类化合物以点阵的形式固定在某种材料制作的底片上,采用高通量扫描技术和荧光染色等手段分析和检测糖分子与其它生物大分子之间的特异性结合,进而研究其生物功能和作用机制。

糖芯片具有检测样品用量少,特异性高,高敏感性,高通量和长期稳定性等优点,极大的提高了糖化学研究的效率,这种芯片可以分成单糖或二糖芯片,寡糖芯片,多糖芯片和复合式芯片,另外根据用途不同也可以分成功能糖组学芯片,药物开发糖体芯片和糖抗原免疫诊断芯片等。

制备糖芯片的方法有非化学修饰糖类固定和化学修饰糖类固定,前者通过点样仪点样将糖直接固定在玻片上,属于非特异性结合,这种方法无需对糖基进行修饰。但是由于糖类化合物的性质,如分子量,空间结构,溶解性,反应位点等都不同,因此有些糖类化合物无法直接以非共价结合的方式直接固定在固体介质上,为此科学家们就需要对糖进行化学修饰,即嫁接上能与载体表明产生特异性结合的基团,然后再固定。

糖芯片与其它技术的结合

糖芯片将糖分子通过共价或非共价作用固定于经化学修饰的基质上, 进而对糖蛋白等待测样品或糖分子探针本身进行测试、分析。与芯片上糖探针存在特异作用的样品分子被吸附, 其他无特异作用的分子则在清洗液的冲洗下被洗掉。通过荧光染色等检测方法可以简单、快速地筛选出存在特异作用的分子,从而在分析糖蛋白结构和功能等方面起到重要作用。

质谱技术是目前糖生物学家应用最为广泛的测定糖链结构的工具。快原子轰击质谱(FAB-MS)、 电喷雾质谱(ES-MS)、基质辅助激光解析离子化飞行质谱是在糖链结构测定方面应用广泛的3种质谱,它们可以直接对样品进行离子化和解析作用以获得信息, 而且可以完整的糖复合物或片段化的样品进行分析。

在利用糖芯片的同时, 可以联合利用质谱技术, 来分析糖蛋白等待测样品或糖分子探针的具体结构。例如, 利用DNA芯片点样仪将糖抗原点印在化学修饰的玻片上。然后把芯片与待测样品温浴, 此时, 待测样品中的配体就会与芯片上的糖分子结合, 而后用类 似于蛋白质芯片中所用的免疫检测技术进行染色分析, 如用抗体 ( 单抗或多抗血清 )或其他糖结合蛋白 (凝集素、 细胞因子等 )进行免疫染色。经抗体染色的玻片可以用生物芯片扫描仪检测荧光信号, 并借助于计算机进行数据处理和分析, 得出有效的荧光信号。最后, 在有效荧光信号所 对应糖芯片的原位进行质谱分析, 分析其具体结构。

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