糖芯片分析实验指导

生物通报道：细胞表面的由脂质和蛋白组成的糖体分子蕴藏着许多奥秘，决定了细胞如何发育，如何相互作用以及沟通。细菌和病毒也就是粘附在这些线性或带分枝寡糖（glycan）上感染细胞的，免疫系统要进行反击，也需要首先学会识别微生物上的糖壳，展开先天和后天的防御。

经过多年的探索，科学家们已经掌握了不少糖体分子的基本生物学特征，但是比较于DNA和蛋白，我们对于这些分子的了解还远远不够，然而由于糖体结构复杂，要想构建出这种分子非常困难，而且与DNA不同，糖体几乎是不可能克隆和扩增的，因此数量也是有限。

近年来一种用于分析遗传物质的新技术被证明适用于糖生物学，这就是芯片技术。第一个糖芯片诞生于2002年，也就是在芯片技术问世后，用于研究基因表达后的第7个年头。

糖芯片由少量多种类的天然或合成的低聚糖组成，研究人员利用这种芯片能识别结合在糖上的蛋白，细胞和微生物。由于芯片制作只需要极少量的糖分子，因此这种技术得以首次能进行蛋白糖亲和性的广泛筛选。

目前有十几个实验室构建自己的糖芯片，随着更多的糖分子被分离和合成出来，这些芯片将会不断完善。目前制造生产最大及最多糖芯片的是一个国际性的研究协会：功能糖组学协会（Consortium for Functional Glycomics，CFG，生物通译），以及英国伦敦帝国学院的糖科学实验室，其它一些实验室则主要是针对自己的实验项目进行小规模的制作。

“在这一点上我认为没有什么单个平台的赢家”美国国家癌症研究所化学糖生物学组组长Jeffrey Gildersleeve说。

由于RNA测序价格下降，DNA芯片已不再像以前那样受到瞩目，但糖芯片的未来却被看好，“我认为未来五年里，（糖芯片）就会开始商业化，进入工业应用和临床应用领域，”埃默里大学医学院功能糖组学国家中心（NCFG，生物通译）主任Richard Cummings说。

糖芯片制备原理

糖芯片的制备原理与基因芯片，蛋白芯片相似，是将多种微量的糖类化合物以点阵的形式固定在某种材料制作的底片上，采用高通量扫描技术和荧光染色等手段分析和检测糖分子与其它生物大分子之间的特异性结合，进而研究其生物功能和作用机制。

糖芯片具有检测样品用量少，特异性高，高敏感性，高通量和长期稳定性等优点，极大的提高了糖化学研究的效率，这种芯片可以分成单糖或二糖芯片，寡糖芯片，多糖芯片和复合式芯片，另外根据用途不同也可以分成功能糖组学芯片，药物开发糖体芯片和糖抗原免疫诊断芯片等。

制备糖芯片的方法有非化学修饰糖类固定和化学修饰糖类固定，前者通过点样仪点样将糖直接固定在玻片上，属于非特异性结合，这种方法无需对糖基进行修饰。但是由于糖类化合物的性质，如分子量，空间结构，溶解性，反应位点等都不同，因此有些糖类化合物无法直接以非共价结合的方式直接固定在固体介质上，为此科学家们就需要对糖进行化学修饰，即嫁接上能与载体表明产生特异性结合的基团，然后再固定。

糖芯片与其它技术的结合

糖芯片将糖分子通过共价或非共价作用固定于经化学修饰的基质上, 进而对糖蛋白等待测样品或糖分子探针本身进行测试、分析。与芯片上糖探针存在特异作用的样品分子被吸附, 其他无特异作用的分子则在清洗液的冲洗下被洗掉。通过荧光染色等检测方法可以简单、快速地筛选出存在特异作用的分子，从而在分析糖蛋白结构和功能等方面起到重要作用。

质谱技术是目前糖生物学家应用最为广泛的测定糖链结构的工具。快原子轰击质谱(FAB-MS)、 电喷雾质谱(ES-MS)、基质辅助激光解析离子化飞行质谱是在糖链结构测定方面应用广泛的3种质谱，它们可以直接对样品进行离子化和解析作用以获得信息, 而且可以完整的糖复合物或片段化的样品进行分析。

在利用糖芯片的同时, 可以联合利用质谱技术, 来分析糖蛋白等待测样品或糖分子探针的具体结构。例如, 利用DNA芯片点样仪将糖抗原点印在化学修饰的玻片上。然后把芯片与待测样品温浴, 此时, 待测样品中的配体就会与芯片上的糖分子结合, 而后用类 似于蛋白质芯片中所用的免疫检测技术进行染色分析, 如用抗体 ( 单抗或多抗血清 )或其他糖结合蛋白 (凝集素、 细胞因子等 )进行免疫染色。经抗体染色的玻片可以用生物芯片扫描仪检测荧光信号, 并借助于计算机进行数据处理和分析, 得出有效的荧光信号。最后, 在有效荧光信号所 对应糖芯片的原位进行质谱分析, 分析其具体结构。

CFG糖芯片

CFG组织成立于2001年，由美国国家综合医学科学研究所为分析蛋白与碳水化合物之间的相互作用而成立。其中一项早期的CFG 项目促使了ELISA-糖芯片的广泛使用，因此在2004年的时候，CFG就开始制造包含200个糖分子的芯片（PNAS, 101:17033-38），时至今日，CFG已经生产出了包含610种哺乳动物糖共价链接分子的芯片。

优点：CFG对于没有大量糖库的研究人员来说是一种十分宝贵的资源，“大多数目标糖分子并不是能买到的，”CFG主席Cummings说，即使是能买到，也需要很多。

CFG哺乳动物糖芯片已经被用在多项研究中了，曾发现了流感病毒的受体亲和性，侵染细胞的凝集素细菌，还有结合在癌细胞表面糖分子的癌症特异性抗体。

最近，来自瑞士伯尔尼大学药理学研究所的Stephan von Gunten等人利用这种芯片确定了健康志愿者血液中结合免疫球蛋白的糖分子（原文：The human IgG anti-carbohydrate repertoire exhibits a universal architecture and contains specificity for microbial attachment sites）。从中他们发现了一些病原体结合的糖分子。

一些免疫球蛋白绑定到哺乳动物的糖，细菌和病毒笼络入侵细胞。研究人员推测人类抗体阻止这些粘附网站为了击败绑定的病原体。

Cummings等人则开发出了一种新技术：鸟枪糖组分析方法（shotgun glycomics，生物通译），这种方法可以帮助研究人员从多种来源（从母乳到猪肺）收集和纯化糖分子，然后观察糖结合蛋白的结合模式，测序糖分子，或者研究人员也可以利用鸟枪芯片识别特殊微生物粘附的糖分子。（原文：Shotgun glycomics: a microarray strategy for functional glycomics）

如何获取：虽然NIGMS在2011结束了资助，但是CFG芯片筛选依然可以通过埃默里大学的 NCFG获得。研究人员如果希望验证自己样品的糖结合特性，那么可以在CFG网站申请埃默里筛查，每张玻片300美元（当地价格）。

帝国理工学院糖芯片

来自伦敦帝国理工学院糖科学实验室的研究人员曾参与研发了最早的糖芯片（Nat Biotechnol, 20:1011-17, 2002），经过十多年的发展，这一研究组的芯片体系已经发展到了830种糖探针了，每一个合成的糖基团都是通过一种称为拟糖脂（neoglycolipid，NGL，生物通译）的脂质标签进行固定，然后点样到涂有硝化纤维的载玻片上，此外芯片上还带有天然糖脂。

芯片优点：这种NGL芯片的脂质，以及糖与载玻片之间的非共价链接，更灵活，令其在多种糖芯片中脱颖而出。“我们这种灵活性十分重要”，芯片原创者之一，帝国理工血液糖科学实验室主任Ten Feizi说。

在单个糖与蛋白质之间的相互作用力并不强，这导致了糖基常常在其表面的多个糖结合位点与蛋白，或者蛋白基团相互作用。蛋白与糖基之间的这种作用力被称为多效价力（multivalent interactions，生物通译）。

所有的糖芯片都需要多效价，因为芯片上并排点样着多个糖链，但是糖基密度和取向（orientation）影响了这些芯片是否能插入到其蛋白结合位点上。Feizi指出，NGL芯片在这一点上做的更好，它们的非刚性链接令糖基可以在蛋白上的多效价结合位点上进行调整。

近年来不少研究人员采用这种NGL芯片取得了重要发现，如病毒，先天免疫系统和癌症研究。Feizi就记得这一芯片曾在2009年的H1N1猪流感病毒感染的糖受体研究中发挥重要作用。当时研究人员发现了甲型H1N1流感病毒感染肺部深处细胞的能力的更多证据：甲型H1N1流感病毒可以与肺部细胞的受体结合，因此能影响呼吸道的更多部分。

研究人员报道称，流感病毒细胞上有类似“钉”状体，能扎入细胞受体，侵入细胞内部完成自我复制，最终破坏细胞，这就是NGL芯片发现的一种在肺部深处的糖分子。

去年，这一研究组又利用这一芯片识别出了一种糖结构：F77，这一结构与前列腺癌细胞粘附的抗体结合在一起（J Biol Chem, 289:16462-77, 2014）。研究人员利用筛选芯片首次分析了这种抗体和糖脂，虽然芯片只揭示出了抗体靶向的碳水化合物，但之后研究人员又发现了一种称为mucins的粘蛋白，从而构建出了“设计芯片”，更精确的分析抗体结合的糖链结构。

如何获取：如果有需要NGL芯片的，可以在线申请：www1.imperial.ac.uk/glycosciences/request/，帝国理工学院糖科学实验室工作人员也可以帮助分析样品（每个药品200欧元）。

利用糖芯片破解癌症之谜

在过去十年里，美国国家癌症研究所的Jeffrey Gildersleeve研究组研发出了一种包含503个天然糖蛋白，合成糖蛋白以及相应对照的糖芯片，他们在这些合成的“新”糖蛋白表面放置了不同排列组合和密度的糖分子，从而用于分析糖分子对蛋白结合的影响。

芯片优点：Gildersleeve研发的这种糖芯片能用于筛选癌症患者的大量血清，并且通过蛋白表面多种组合和密度的分析，也可以深入了解多价结合的具体内容，解析哪种组成的糖分子会与哪种蛋白结合，以便在研究中进行复制。

“我们希望能识别出血清中抗体亚群，这与癌症治疗密切相关，”他解释道，这些抗体的亚群目前只能通过其结合的糖进行区分。

Gildersleeve研究组近年来备受关注，其中的一个主要原因就在于他们成功的区分了前列腺癌患者体内的抗体，这将有助于预测并分析患者对III期癌症疫苗 PROSTVAC-VF 的治疗疗效。

“大多数癌症治疗——尤其是癌症疫苗和其它癌症免疫疗法的主要挑战，就在于这些方法只对部分患者有效，而大多数患者无法从中获益，”Gildersleeve说，如果能发现预测患者治疗过程中的疗效，那么就能帮助临床医师们寻找最佳方案。

利用这种芯片，研究人员在患者进行II期临床疫苗试验前，就对他们的血清进行了分析，结果发现那些体内与一种血型A抗原结合的免疫球蛋白量增多的患者，其存活率比平均值要高（Clin Cancer Res, 19:1290-99, 2013）。此外，研究人员还发现接种疫苗的患者，其体内对Forssman抗原的抗体也会增多，他们指出用血液测试评估的这种早期免疫应答与接受疫苗治疗的前列腺癌病人的长期存活有相关性，这指出可能存在一种生物标记，用于评估这种疫苗的效果，并且提示抗聚糖免疫应答可能对于评估其他抗癌疫苗具有重要意义（Humoral response to a viral glycan correlates with survival on PROSTVAC-VF）。

如何获取：Gildersleeve实验室愿意帮助其他研究人员利用他们的芯片进行研究，他们感兴趣的是癌症或艾滋病相关的工作。

微生物糖芯片

虽然大多数的糖芯片主要聚焦与哺乳动物的糖分子，但是一些研究人员也尝试分析了一些微生物中的糖。去年来自Scripps研究院的Cummings和Jim Paulson研发出了一种包含大约350个微生物糖分子的芯片，这些糖来自不同的物种。

芯片优点：CFG大约在十年前开始构建微生物糖芯片（microbial glycan microarray，MGM），但是之后由于其资助单位：NIGMS决定停止资助后就没有再进行这一项目了。

不过Paulson和他的同事近年来又重启了这项研究，并在2014年推出了一个新的改进版本（Nat Chem Biol 10:470-76），他们借助于一种载玻片，其上面涂有来自于细菌（这些细菌很多发现于肠内）的300多种不同多糖（在细胞表面发现的糖类），发现了一个蛋白质家族：半乳凝素（galectins），它们能识别并杀死那些糖涂层非常类似于我们自身细胞的细菌。

为了避免自身免疫的攻击，我们的身体通常不会产生对抗我们自身细胞上分子的抗体。因此，这就给我们的免疫防御留下了可被细菌利用的不足之处。研究人员发现，这些不足之处有一些是通过半乳凝素弥补的。这一发现扩充了2010年发表于《Nature Medicine》的一项最初发现，描述了可识别并杀死表达人类血型B抗原的细菌的半乳凝素。

这种芯片只需微量血液（只是几滴）就能识别人类抗微生物多糖抗体的发育和年龄特异性差异，研究人员认为这种糖芯片能替代以前的技术。

如何获取：这种芯片可以通过CFG付费获得。

（生物通：张迪）