如何打造出艺术品般的免疫荧光图像?[心得点评]

【字体: 时间:2015年04月07日 来源:生物通

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  每每看到那些艺术品般的细胞图像,我们当然希望能亲手创作一幅。然而,对于固定细胞的染色,并没有理想的操作步骤,因此实验过程少不了优化。免疫荧光实验的染色过程一般分为六个步骤:样品制备、固定、透化、封闭、抗体孵育和封片。在此,赛默飞世尔的技术专家Jason Kilgore给出了一些建议,能帮助您优化每个步骤,打造出一幅精美的艺术品。

每每看到那些艺术品般的细胞图像,我们当然希望能亲手创作一幅。然而,对于固定细胞的染色,并没有理想的操作步骤,因此实验过程少不了优化。免疫荧光实验的染色过程一般分为六个步骤:样品制备、固定、透化、封闭、抗体孵育和封片。在此,赛默飞世尔的技术专家Jason Kilgore给出了一些建议,能帮助您优化每个步骤,打造出一幅精美的艺术品。

1. 样品制备

在培养过程中,使用正确的培养基、血清、温度和CO2浓度是必不可少的。同时请记住,您的培养方式也要与您的成像平台相契合,比如,正置显微镜通常需要盖玻片上的细胞,而倒置显微镜能够成像多孔板中的细胞。在开始免疫荧光操作之前,需要经常检查细胞的健康状况和汇合度。是否有足够的细胞?它们的形态是否符合预期?

Tip #1 – 在开始优化之前,确认您的细胞表达了目标抗原。这似乎很简单,但真的有许多研究人员忘了做个简单的western blot,而直接跳到免疫荧光染色。

Tip #2 – 优化缓冲液,这方面往往被人忽视。在固定和透化之后,孵育和洗涤过程中要用到缓冲液,而使用正确的缓冲液会对信号强度产生很大的影响。大多数研究人员都使用PBS,但有些缓冲液(如PHEM或CSK)在较低pH值下使用,可能对细胞骨架或细胞质抗原有帮助。

2. 固定

在所有的孵育和洗涤过程中,让细胞尽可能地保持完整,这有点棘手,也非常关键。固定是维持细胞结构的关键一步。市场上出售的许多一抗都经过某种固定剂的验证,但新的抗体则需要反复优化。

目前有两类固定剂可供选择:醛类固定剂和有机溶剂。醛类固定剂让细胞骨架和膜上的蛋白互相交联,因此是标记这些结构中的抗原的首选方法。然而,这种方法可能对蛋白进行化学修饰并遮蔽它们,使得检测更加困难。基于甲醛的Image-iT® Fixation/Permeabilization Kit就是个不错的选择,它适用于大多数细胞类型。有机溶剂,如甲醇、乙醇和丙酮,不会通过交联而改变蛋白,但它们使蛋白变性和沉淀。对于那些深藏不露的抗原,比如细胞核中的,这种方法可能还不错。

Tip #3 – 不要使用有机溶剂来固定那些含有荧光蛋白标签的细胞。这可能会使标记的融合蛋白变性,而没有信号。

Tip #4 – 对抗固定剂诱导的自发荧光。一些样品容易因固定剂诱导而产生自发荧光,这可以通过醛基的还原来缓解。戊二醛在自发荧光上特别糟糕。

Tip #5 – 可能需要抗原修复。如果抗原被遮蔽,它往往可通过热、压力或柠檬酸盐缓冲液处理来修复。这些方法已经很成熟,而有些抗体会推荐一种方法。

3. 透化

透化能帮助抗体穿过细胞膜,进入固定细胞的内部。目前有许多不同的去污剂,能用于细胞透化,包括NP-40、Triton X-100、Tween-20和皂素等。

透化的程度需要取决于抗原的位置。例如,如果您的目的蛋白位于细胞膜或细胞外基质中,您可能不需要太多的透化。不过,对于细胞间的目标,需要透化才能让抗体达到抗原。时间和浓度都需要优化,不过也可以试试Image-iT® Fixation/Permeabilization Kit。

Tip #6 – 优化您的固定和透化方法。尝试一下不同的化合物,以及不同的时间和浓度。您也要寻找状况良好的细胞或组织,以及特异的染料。有时,查查文献,说不定有用。


4. 封闭

封闭抗体的非特异结合,将改善免疫荧光染色的结果。牛血清白蛋白和热灭活的血清可作为非特异性的封闭剂,不过市场上也有一些商业化的产品,如BlockAid™ Blocking Solution。在抗体孵育之前,加入封闭溶液。

Tip #7 – 仔细选择封闭溶液。不要选择与一抗同一物种的血清哦。

Tip #8 – 可能需要其他的封闭溶液。因染料电荷而引起的非特异性结合可通过Image-iT FX Signal Enhancer来阻断。而一些细胞和组织中常见的内源性过氧化物酶、磷酸酶或生物素,则需要特殊的方法来封闭。

5. 抗体孵育

真正的检测步骤包括用一抗以及染料标记的二抗孵育细胞或组织。同样,终浓度和孵育时间都必须精心优化,对于培养细胞的显微镜观察,通常为0.5-10 µg/mL,室温下30-60分钟。多个一抗可在同一步骤中混合使用。

一抗的检测还必须有一个染料标记的二抗,它针对一抗的宿主物种。在使用多个一抗时,要确保不同的二抗经过其他物种的交叉吸附,以免造成信号混乱。当然,染料要与滤光片匹配,而且最好是明亮又稳定的,如Alexa Fluor染料。

Tip #9 – 使用最好的一抗。这是整个过程中最重要的一部分。如果做好了,您将得到一个马上能发表的结果。完美的抗体有着良好的亲和力和特异性,您值得拥有。不过如果您自己制备,记得花时间设计好抗体。

Tip #10 – 使用适当的对照。您需要一个无一抗(只有二抗)的对照来检验二抗的特异性。同时,无抗体或染料的对照可检测自发荧光。如果使用多个一抗,记得开展单个抗体的对照实验,以检验交叉标记。

6. 封片

一旦最后一次洗涤完成,标记好的样品将放在成像环境中,最佳地保留染料信号。尽管放在缓冲液中的细胞也能成像,但最佳的选择是将细胞放在抗淬灭的封片剂中,保留初始信号并减少光漂白,而且折射率足够高,可带来出色的分辨率。

Tip #11 – 选择适合您的成像时间的抗淬灭剂。如果您马上成像,然后丢掉玻片,抗淬灭剂可以是液态的,比如SlowFade Diamond。不过,如果您想保留这块玻片,迟一点再成像,那么您可以选择ProLong Diamond,它在24小时内固化。

详细了解赛默飞世尔的SlowFade/ProLong 抗淬灭剂

(生物通 余亮)

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