BioTechniques：细胞培养条件影响GFP的光稳定性

　　

生物通报道 光稳定性（photostability）是荧光蛋白的一个重要特征。不过，它并不是一成不变的。俄罗斯科学院生物有机化学研究所的研究人员发现，活细胞中绿色荧光蛋白（GFP）的光稳定性受到培养基组分以及细胞生长条件的影响。这项成果发表在《BioTechniques》5月刊上。

由于荧光蛋白具有自发发出荧光的独特能力，它们被广泛应用于追踪基因表达、标记感兴趣的蛋白质，和实时监控细胞的生理状况。野生型的GFP来自水母，尽管它发出绚丽的荧光，但在高等动物的细胞中，它的光谱并非最佳，且在37ºC不能正确折叠。不过，这些问题在不久之后就通过突变解决了。增强型GFP（EGFP）可能就是人们最熟知的突变体。

当然，除了荧光亮度，光稳定性也是荧光蛋白的一个重要特征。延时显微镜、3D图像重建和单分子检测等应用会受到光稳定性的影响。为了提高荧光蛋白的光稳定性，人们广泛采用了定点突变和随机诱变。最近，研究人员也建议对成像培养基的组分进行优化。这是因为，GFP参与了光驱动的氧化还原反应，导致绿色到红色的光转换。因此，培养基组分对这些反应的抑制可增强绿色通道的光稳定性。

于是，俄罗斯的研究人员测定细胞生长条件和培养基组分对EGFP光稳定性的影响，以便找出EGFP成像的最佳条件。他们利用EGFP-C1载体转染了HEK293T细胞，并在转染48小时后用Leica的AF6000 LX荧光显微镜成像。在成像之前，细胞培养基被更换成新鲜的DMEM或其他待研究的培养基（Ham's F12和RPMI 1640）。

他们发现，所有培养基都不影响EGFP在细胞中的初始亮度。在DMEM和RPMI 1640中表达的EGFP光稳定性几乎相同，不过芸香叶苷的添加使光稳定性增加了数倍。相比之下，Ham's F12培养基则带来了非常高的EGFP光稳定性（DMEM的6-7倍），且几乎不受芸香叶苷的影响。

与DMEM相比，F12培养基的核黄素和吡哆醇的浓度降低，而这些维生素会明显降低EGFP的光稳定性。同时，氧化还原活性化合物，如氰钴胺（微生物B12）、硫辛酸、次黄嘌呤和胸苷的浓度增高。研究人员进一步发现，这些化合物单独添加到DMEM培养基中，对EGFP的光漂白没有任何影响，不过它们的组合能使光稳定性提高2倍。

此外，他们还发现，EGFP的光漂白速率在很大程度上取决于细胞的生长条件，如细胞密度和血清的浓度。在2% FBS下检测到最低的光稳定性，而20% FBS下最高。对于DMEM培养基，这两者的差异在2.5-3倍。

基于这些研究，作者认为，荧光蛋白光稳定性的比较应尽可能在相同的条件下平行开展，而将不同论文中的数值拿来比较是非常不准确的。（生物通 薄荷）

原文检索

Influence of cell growth conditions and medium composition on EGFP photostability in live cells

BioTechniques, Vol. 58, No. 5, May 2015, pp. 258–261