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微生物学经典技术改进及新技术范例

【字体: www.ebiotrade.com 时间:2016年7月1日 来源:生物通

摘要:

  包括细菌在内的微生物研究常常需要追踪和分析这些生物的动态行为,时至今日这些技术已经得到了长足发展,出现了一些新的工具,如荧光蛋白报告基因,经典技术也获得了新生,如琼脂糖平板上细菌菌落复杂漩涡和螺旋形生长的定量分析等。同时在过去的二十年里,显微镜又卷土重来,通过一些小型,相对廉价的相机,以及日益复杂的图像分析工具帮助科学家们完成了许多分析研究。

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——经典技术改进,以及全新的技术将能帮助微生物学家更深入的进行研究

生物通报道:自从1673年列文虎克用他自己制造的显微镜观察到了被他称为“小动物animalcules”的微生物世界之后,生物学进入了微生物阶段。这些微小的动物具有如此惊人的多样性,无论是人体肠道,还是海底世界都充斥着它们的身影,但在此后有了DNA的跨时代发现,微生物就不再是研究的宠儿了,不过依然有不少科学家继续进行对其各种行为的研究。

包括细菌在内的微生物研究常常需要追踪和分析这些生物的动态行为,时至今日这些技术已经得到了长足发展,出现了一些新的工具,如荧光蛋白报告基因,经典技术也获得了新生,如琼脂糖平板上细菌菌落复杂漩涡和螺旋形生长的定量分析等。同时在过去的二十年里,显微镜又卷土重来,通过一些小型,相对廉价的相机,以及日益复杂的图像分析工具帮助科学家们完成了许多分析研究。

The Scientist杂志汇总了一些创新方法,以及经典方法的升级版。

细菌菌群形态分析

早期的微生物学家能通过不同的漩涡和条纹很快的识别出培养皿中的细菌菌株,菌株之间的简单相互作用也很容易辨别——当竞争性的居住在统一培养皿中生长时,就会形成被称为Dienes line的边界,这种边界用肉眼可以清晰的看到。然而对于更复杂的一些动态过程,我们的肉眼就无法准确判断,容易出错了。

来自特拉维夫大学的生物化学与细胞生物学副教授Eshel Ben-Jacob,以及MicroDish公司的首席科学官Colin Ingham利用数学和物理学方法定量分析细菌菌落形态模式。Ingham曾是瓦赫宁根大学的资深科学家,他与Ben-Jacob合作,分析后者实验室在上个世纪90年代发现的一种模式形成细菌:Paenibacillus vortex(旋涡状类芽孢杆菌,生物通注),这种细菌被称为细菌界的“爱因斯坦”,其“智商”在细菌界数一数二。

研究人员利用一些传统经典的方法观察菌落模式,细菌群集(Bacterial swarming)方法在正常状态下可行,但在调控增长条件下,研究人员会给细菌施加不同的胁迫压力,比如缺乏营养,或者改变湿度。然后他们就会对这些菌群进行染色和成像,从而计算出这些因素对细菌的运动性和模式形成的影响。

“这些都是非常简单的技术,”Ben-Jacob说,“但你需要观察菌群生长水平,以此来了解(细菌)相互之间的沟通情况。”

通过两个研究组的合作,Ingham和 Ben-Jacob发现旋涡状类芽孢杆菌在软琼脂糖上有类似交通管理的形态模式,而在硬琼脂糖上,这种细菌就会形成复杂的菌群形态,沿着中心点形成漩涡,就像它的名字一样。

研究人员拍摄了突变细胞的成像图案,并测量了两种条件下细菌的形态特征,从而首次定量描述了旋涡状类芽孢杆菌的群集动力学机制。(BMC Microbiol, 8:36, 2008)

此后研究人员又总结了决定细菌菌落的一些简单规则(PLOS Comput Biol, 7: e1002177, 2011),并指出了旋涡状类芽孢杆菌与非运动性真菌烟曲霉(Aspergillus fumigatus)之间的相互作用。

对于技术操作,Ingham强烈推荐了一款公共成像处理和分析软件:ImageJ,这款软件由美国国立卫生研究员NIH开发,可以在线下载。软件还包括了多种针对不同应用的插件。

微生物学家可以利用ImageJ分析拍摄细菌的视频,分析它们的形状和动态过程。同时NIH网站也会回答和解决一些用户的提问,“如果能找到人解答你的难题,那就再好不过了,”Ingham说。


一次追踪多个细菌

通常情况下,研究人员都需要费力地追踪在他们视野的单个细菌。细菌单一轨迹有助于得到关于这种细菌运动的一般性结论。然而现在的成像技术和计算机技术已经能帮助研究人员同时捕获和分析多个细菌轨迹了。

来自伦敦大学学院的Gabriel Rosser看到他的一个同事费尽心力收集了数以百计细菌的活动轨迹,希望能帮助解决这一问题,“我知道他有自己的方法,但是他并不确定如何寻找轨迹的起点,”Rosser说。

为了解决这一问题(不用分别建立追踪亚集),Rosser与来自牛津大学的Alexander Fletcher合作,研发了新的运算法则,可以一次处理所有的追踪进程,筛选掉那些轨迹太凌乱或不可能存在的轨迹,“一旦你选择了一种细菌,那么就有可能出现筛选,”Fletcher说,平常我们都需要筛选那些好的轨迹:更直、更长,更容易地分析,而在这里,计算机帮我们完成了这一工作。

研究人员分析了红假单胞菌Rhodobacter sphaeroides,这是一种使用单一鞭毛运动,自由游动的杆状细菌。由于这种细菌很小,因此其周围分子的随机布朗运动都会导致它们偏离直线运动,为此研究人员采用了一种称为“run-and-tumble(运动翻滚,生物通译)”的方法,在细菌停下来之前进行快递的旋转或鞭毛拂动,令其保持短暂的直线运动。

通过新的运算法则,研究人员发现这种细菌翻滚阶段的出现并不是随机的,这与之前科学家们认为的相反,“它们改变得太快,以至于变成了一个被动的过程,”Rosser说。

要进行这种分析,Rosser说,可以在他们的论文中找到详细的过程(PLOS Comput Biol, 9: e1003276, 2013)。只要是一般采用成像捕获软件获得的细菌轨道都可以用这个工具进行分析,其中的一些应用可能与菌种有关,“但相关的分析具有一般适用性,”他说。


感染期少量细菌如何检测

许多病原菌,比如结核杆菌在初始生长阶段生长的十分缓慢,因此要了解其如何感染宿主的并不容易。至今科学家们还不清楚结核分枝杆菌Mycobacterium tuberculosis在人体内的立足点在哪里,是肺泡?鼻咽?还是散布在全身的病原体?

“如果能在体内追踪到这些病原体,就是这一领域的一大进步,”来自德州A&M健康科学中心的微生物病理学和免疫学教授Jeffrey Cirillo说。

为了能找到样品中少量的结核杆菌的踪迹,Cirillo研究组研发了一种新技术,利用荧光报告基因来检测——结核杆菌会分泌一种名为BlaC的酶,据此研究人员设计出一种能与这种酶反应的分子,两者反应后会发出荧光。在此基础上制成的检测装置只需在其中加入痰液,若含有结核杆菌,检测装置就会发出荧光。如果自行检测者拿不准如何判断荧光,可用手机拍照后传给专业医生,无须亲自到医院就能获知检测结果。

这种新型检测方法灵敏度很高,样本中只含少量的结核杆菌就能检测出来。与之相比,传统的利用显微镜观察样本中是否含结核杆菌的方法,在结核杆菌数量很少时常常判断困难。

其实之前也有类似的技术,但所用分子不只对结核杆菌敏感,也会引起其他一些种类的细菌产生反应。而这一研究针对这一问题进行改进,所用分子只有遇到结核杆菌分泌的酶时才发出荧光。

这一系统能检测到样品中少至10个细菌(Angew Chem Int Ed Engl, 53:9360-64, 2014),Cirillo 还在尝试研发另外的生物萤光分子(来自萤火虫)追踪活体动物中的感染的新系统。、

这一报告系统是在其它研究发现的基础上研发出来的,Cirillo 研究组进行了一些改动,从Addgene 开放性数据中可以活动这种质粒的信息。


细菌如何被推动的

科学家们已经发现了细菌微生物如何从能在多种结构中游动的秘密,但是不同的细菌如何利用这些结构推动其自身行走依然是个迷,需要通过显微检测这些推动力。

鞭毛Flagella是细菌用来游泳和入侵宿主的微小的鞭子状结构,科学家们发现鞭毛的构建和运转至少需要50个基因。“但是我们并不知道细菌是如何进行表面移动的,”来自布鲁克林学院的Nicolas Biais说。

Biais研究组一直致力于分析细菌上的一种称为IV pili的结构,Pili又称纤毛(fimbriae),是毛发样的粘附结构,感染时帮助细菌在人体细胞上粘附和形成菌落,其它引发人类感染的细菌也产生相似的pili或纤毛,加剧感染。霍乱弧菌Vibrio cholerae 和淋病奈瑟菌Neisseria gonorrhoeae上就这种结构,Biais将它们称为“小型蜘蛛侠”,因为这些细菌能利用pili拉动自身,与其它细菌相互作用,并吸附到感染宿主的上皮细胞上。

为了研究这种细菌结构,Biais实验室采用了三种方法,这些方法都能令细菌与其它物体相互作用。首先Biais利用光镊(ptical tweezers)在细菌中加入了蛋白包裹的微珠,细菌就会爬上这些微珠上。通过检测微珠移动的位置,研究人员就能了解细菌的拉动力。同时通过显微相机拍摄这一过程,并利用ImageJ 或 MATLAB进行分析。

但是这种方法有一个弊端,那就是激光会产生热,改变细菌的行为,为了最大程度的还原细菌的活动,Biais等人有构建了一种聚合物支柱,这类似于计算机的那些模块芯片。细菌能在这些微柱上移动,就像蜘蛛侠穿过摩天大厦,Biais检测每个“摩天大厦”的弯曲程度,从而来检测细菌的运动。

第三种方法是磁镊(Magnetic tweezers,生物通注),这更便宜,也更容易在不产生热的条件下发挥作用。同样研究人员也是将磁珠放到细菌中,检测它们的行为。不过这些磁镊不像第一种方法那么灵活,因此大多用于分析那些已知的拉力。

通过组合这些研究工具,Biais 研究组通过对淋病奈瑟氏球菌的研究,发现一束纤毛收缩时的力量可达到单根纤毛的十多倍。这种驱动收缩的分子马达是已知动力最强的纳米生物马达。这一发现通过对菌毛的研究可以帮助解决各种致病菌的治疗难题(PLOS Biol, 6:e87, 2008)。

要想进行这些实验,首先激光仪器不便宜,而且无论是光镊,还是磁镊都需要通过微柱进行校准。相关内容可以参考Biais在一篇文章一个章节中提到的具体内容(Methods Mol Biol, 799:197-216, 2012),其中包括如何制造微柱。另外Biais也在另外一篇文章中详细介绍了磁珠(Methods Cell Biol, 83:473-493, 2007)。不过鉴于各种细菌拉动力的不同,需要参考研究人员本身的目标细菌。

生物通:张迪)

(http://www.ebiotrade.com/)
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