KASP——基因分型研究者指尖跳跃的珠链

【字体: 时间:2015年05月26日 来源:

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  KASP技术不需要针对每个SNP位点都去合成特异的荧光引物,它基于自己独特的ARM PCR原理,让所有的位点检测*终都使用通用荧光引物扩增,这大大降低了LGC KASP的试剂成本,既有金标准的准确,又降低了使用成本,比Taqman还具有更好的位点适应性,所以在医学、农学检测方面LGC KASP都有非常好的应用。

说起SNP Genotyping,大家熟悉的产品很多。例如*经典的Taqman荧光探针法,至今也是Genotyping的金标准。还有Sequenome Massarray飞行时间质谱法,在医学方向应用很多,也有很多商品化检测试剂盒,不过Sequenome需要引物组合做多重PCR,摸索优化难度比较大,耗材成本也不低。前几年大家经常提起的,高分辨熔融曲线HRM也算一个吧,HRM以高灵敏,低成本,灵活的优势深受不少科研工作者的喜爱,只是这项技术对于引物设计和实验操作,仪器的灵敏度和重复性要求都比较高,HRM都是针对一段DNA片段而不是一个位点进行熔融温度差异分析,片段的长短,碱基差异,碱基构成都是影响因素,重复性并不好,HRM更适合于寻找突变体,而非SNP检测,所以大部分客户体验并不好。

那么今天要分享的基因有限公司代理产品,英国LGC公司的KASP技术,原理上类似Taqman检测,也是基于终端荧光读取判断,每孔采用双色荧光检测一个样本的一个位点可能的两种基因型,不同的SNP模板对应不同的荧光产物。所以这项技术的准确度与金标准Taqman一致,而KASP技术与Taqman技术不同的是,它不需要每个SNP位点都去合成特异的荧光引物,它基于自己独特的ARM PCR原理,让所有的位点检测*终都使用通用荧光引物扩增,这大大降低了LGC KASP的试剂成本,既有金标准的准确,又降低了使用成本,比Taqman还具有更好的位点适应性,所以在医学、农学检测方面LGC KASP都有非常好的应用,并在一系列高水平的文章中都有体现,后续我们会继续介绍。

从具体技术上比较,Taqman探针,一般采取8-12个bp的长度,围绕SNP位点两端进行设计,但对于整个基因组,如此短的探针,可能导致存在多个同源序列进行扩增,造成背景增高,目标位点的完全匹配杂交信号降低,相对而言,KASP的特异性引物通常采用24-26bp,会有更高的特异性,SNP call rate会更高。

另一种情况,可能存在相邻只有几个bp的SNP位点,Taqman探针设计的转化就很困难,因为Taqman的SNP位点必须设计在探针的中间,有可能杂交信号很弱,同样,如果目标位点存在单碱基多次重复序列,Taqman探针方法转化也也很困难,对于这两类位点,KASP方法,因为是末端识别目标位点,可以很好的解决此事。

除了检测SNP位点以外,因为引物片段达到24-26bp,KASP还可以适用于检测较大片段的插入Indels。

还有一个优势,就和钱包有关了,关键问题一,质保期,因为KASP是分成非标记的引物和荧光标记的Master Mixer两部分保存,前者是非荧光标记,质保期长,后者是长期通用性消耗品,客户根据自己消耗量进行采购,浪费少,而Taqman探针是荧光标记的,每一份都是针对特定位点设计合成的,如果有效期内不能充分使用,就会浪费。

别只算纸面成本,那都是假设使用充分为前提的,还是设想一下实际应用场景吧,打开超低温冰箱看一下,前任们留下了多少荧光探针呀,那都是老板的钱呀。

关键问题二,对于新位点的摸索优化条件,只需要设计引物就行了,就和您做一个新的PCR实验相当,KASP技术与客户本身的PCR体系更为接近,其优化也更简单,更有效率。无需订制Taqman探针,甚至购买昂贵的Massarray耗材,据说有个大牛规定,严禁学生私自使用Sequenom 进行新位点摸索,防止掉进坑里。

KASP技术,就是基因分型研究者指尖跳跃的珠链,随性,灵动。

在SNP的系统性研究中,我们一般首先使用NGS测序,构建研究物种或性状的SNP数据库,或者直接调用公共数据库,然后使用芯片或者其他中等密度SNP研究平台在实验组和对照组中进行SNP的筛选,也就是所谓的"GWAS“全基因组关联分析,当候选SNP的数量降到几十个或更少时,也就是低SNP密度高样本通量时,KASP就是*合适的技术了,可以用于replication实验组,进行大样本量的分型。

KASP技术具有灵活、便宜、准确的特点,采用KASP技术进行SNP检测的文献连篇累牍,目前已经超过2000篇,其中的著名刊物比比皆是,略举一二。

2014年1月Nature Genetics发表题为“A genome-wideassociation study identifies multiple susceptibility loci for chroniclymphocytic leukemia”的文章,这篇关于慢性淋巴细胞白血病的研究先是使用全基因组高密度SNP芯片进行GWAS分析,得到若干候选SNP,为了判断这些候选SNP是否与表型相关,又设计replication组进行验证,合计2组,分别是803/2780(case/control)和341/371,全文在4295个人中分析GWAS分析中得到的7个候选SNP,反应量超过3万,用的就是LGC KASP技术。

2013年11月Blood发表题为“Variation at 10p12.2 and 10p14influences risk of childhood B-cell acutelymphoblastic leukemia and phenotype”的文章,英国癌症研究所基于German GWAS研究已经证实7p12.2,9p21.3,10q21.2,14q11.2与BCP-ALL相关。在此基础上他们吸收了前人发表的同类GWAS数据进行Meta分析,联合分析后找出8个位点进入replication验证,使用的就是KASPar平台,*后找出2个相关位点,rs10828317和rs3824662,分别影响了PIP4K2A和GATA3基因,都与ALL显著相关。而且后者可以作为生存率的判断指标。

2013年6月Science发表题为“Identification of Wheat GeneSr35 ThatConfers Resistance to Ug99 Stem Rust Race Group”的文章,鉴定了小麦的抗杆锈病基因CL9,是典型的对QTL进行精细扫描来鉴定功能基因的思路。Sr35是之前在一粒小麦(Triticummonococcum)中确定的含抗杆锈病基因的QTL,该QTL在3Am染色体的长臂,长度大约是2.2-3.1cM(1cM大约是100万对碱基的长度)。该QTL有很多基因,Science该文就是对该QTL进行精细扫描,来寻找具体的抗杆锈病基因。首先,在该QTL内,进行7个分子标记(ssr等)的扫描,把候选基因锁定在2个分子标记之间,该区域长度大概为0.97cM;接着,在一粒小麦的抗病品系DV92的BAC文库中筛选出含此QTL的BAC克隆,对含此QTL的3个BAC克隆进行NGS测序,长度为307,519bp,并对其中的多个基因进行生物信息学分析。对该区域进行进一步分子标记(SSR等)分析,发现其中213kb区域内的4个基因(APGG1,CNL4, CNL6, CNL9)是抗杆锈病候选基因。进一步,对不同的一粒小麦的这4个基因进行一代测序,鉴定出2个抗性单倍型和6个易感单倍型;被测序的小麦包括24种抗杆锈病的和25种杆锈病易感的。所有易感的一粒小麦的CL9基因都具有突变,其中3个SNP导致编码氨基酸的序列改变。其中测序发现的SNP的后续分析就是采用KASP技术(8微升体系,在StepOnePlus™ Real-Time PCR System (AppliedBiosystems)运行检测,KASP技术的另一个突出特点就是仪器系统的开放性,使用实验室本身的定量PCR进行检测,事先进行测试设定就可以了)。

随着KASP的技术不断成熟,越来越多的实验室选择相应的LGC SNPLine仪器平台,建立自己的高通量SNP分析平台,基因有限公司也已经引进全套仪器平台,开始高通量SNP技术服务工作,对于研究SNP的科学家而言,又多了一种选择。

对于LGC公司,KASP技术,SNP技术服务,有任何问题,请咨询您身边的基因有限公司人员

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