研究细胞信号通路,从激酶入手

【字体: 时间:2015年05月29日 来源:生物通

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  一般来说,探索细胞信号通路往往意味着研究磷酸化,比如分析激酶活性,甚至副产物(如ADP)。在此,我们就来看看研究人员如何通过监控激酶活性来研究细胞信号通路。

短信已成为现代社会中一个必不可少的沟通渠道。在细胞中,磷酸化事件充当了这一渠道。大量相互连接的细胞信号通路依赖激酶(和磷酸酶)将关键信息传递给一系列信使,有时候甚至从膜结合的表面分子一路传递给转录因子。

许多信使分子本身就是激酶,有若干个丝氨酸、苏氨酸和酪氨酸残基,能够可逆地接受无机磷(Pi)。检测它们的磷酸化状态,包括在疾病状态下如何改变,或如何被小分子所改变,是药物筛选和基础研究中的核心一环。

一般来说,探索细胞信号通路往往意味着研究磷酸化,比如分析激酶活性,甚至副产物(如ADP)。在此,我们就来看看研究人员如何通过监控激酶活性来研究细胞信号通路。

特异检测?

药物开发和生物技术中所使用的许多筛选都是生化分析,利用单个纯化或重组的激酶将底物磷酸化。据赛默飞世尔研发部门的副总监Kurt Vogel介绍,经典的工具要算时间分辨荧光共振能量转移(TR-FRET)分析,它们寻找不同条件下磷酸化活性的改变。在这个分析中,“底物通常是一个小的肽段,标有荧光基团。而磷酸化特异的抗体上标有另一个荧光基团。这样当抗体与磷酸化的肽段结合时,这两个荧光标记彼此接近,可以发生FRET。”

一旦确定了目标化合物,人们也可以进行反向筛选,也就是换一换,通过单个化合物来筛选不同的激酶。

不过,在生物医学研究中,人们希望了解细胞信号通路系统,以及它们如何受到不同因素的影响,譬如生长因子、毒素或药物。“你需要测定细胞裂解液中信号蛋白的酶活,这是目前最具挑战性的,”Kinexus的首席科学家Steven Pelech谈道。

问题在于“今天我们还没有可靠的分析来测定细胞裂解液中特定激酶的活性,”Pelech解释。由于大部分肽段和蛋白质底物都是混杂的,它们能被各种内源性激酶磷酸化,因此你实际上同时测定了几种不同的蛋白激酶。

发光报告

过去的方法是将裂解液分成几部分,测定放射性Pi的掺入。不过,出于成本、安全和处理等方面的考虑,这种分析现在已经不再流行。

放射性的分析形式已经基本上被发光分析和荧光分析所取代。前者的代表是Promega公司的ADP-Glo™ Kinase Assay,它动态范围宽,灵敏度高,几乎适用于任何以ADP为产物的酶活检测。而后者则有赛默飞世尔的Adapta® Universal Kinase Assay和DiscoveRx的ADP Hunter™,它们都检测磷酸化的副产物ADP。

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同时,磷酸化位点特异的抗体也受到了研究人员的欢迎。这种检测依赖于抗体与磷酸化蛋白之间的特异性和亲和力,为新的免疫分析技术的开发打开了大门。此外,赛默飞世尔的Omnia® Kinase Assay利用在磷酸化时发荧光的肽段来实现动力学分析。这种形式能校正假阳性(化合物自发荧光)和假阴性(淬灭),将干扰降至最低程度。

不过,Pelech也指出,即使是过柱分离的裂解液,也通常含有特异性重叠的激酶。Promega的高级研究员Said Goueli表示,一个解决办法就是使用你感兴趣的激酶的选择性抑制剂。重要的是确定抑制剂本身并不是混杂的,因此在加入选择性抑制剂前后所观察到的活性差异主要是来自感兴趣的激酶。在处理纯化的材料时,激酶混杂并不是个问题。

更多工具

大多数激酶分析都依赖于抗体,要么检测和观察,要么捕获或分离特定的蛋白质,用于后续研究。在这些技术中,最经典的要数Western blot和ELISA,当然也有更先进的技术,如HTRF(均相时间分辨荧光)及其他TR-FRET技术。它们包括赛默飞世尔的LanthaScreen和PerkinElmer的AlphaLISA等平台。

在质谱分析之前,使用抗体来富集样本是另一种广泛使用的方法。Cell Signaling Technology的PTMScan产品及服务就使用motif抗体。据CST的首席科学家Matt Stokes介绍,这些抗体识别特定的翻译后修饰,如磷酸酪氨酸、磷酸丝氨酸/苏氨酸及其他PTM,从单个样品中免疫沉淀各种肽段。此外,一些供应商则使用金属螯合磁珠来富集磷酸化产物。

Kinexus的Kinex™ KAM-880抗体芯片使用877个pan和磷酸化位点特异抗体,在许多情况下能区分磷酸化和非磷酸化的状态。“我们这套芯片的售价大约为750美元,因此只需要三个抗体的成本,你就能得到分析877个表位所需的一切,”Pelech谈道。每块芯片上一式四份的设计适合平行检测两个样本。

如今有许多技术可剖析细胞信号通路的节点,搜索它们在何处融入更大网络的线索,或研究它们如何被扰动。分析可能基于活性或结合,可能基于细胞或生化,可能是低通量或高通量的,通用的或特异的。总之,你不会也不想只用一个。

(作者:Josh P. Roberts / 生物通编译)

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