KASP在转化医学方向的应用

一、分子标记物与疾病

分子标记物是反应疾病状态的化学或生物类物质，它们的存在或者变化可以表示疾病的潜在遗传因素、疾病的性质，借以了解疾病的发生、发展，以指导对疾病的诊断、分型，分期，个体化用药以及预后。

SNP，单核苷酸多态性（Single Nucleotide Polymorphisms）作为第三代分子标记物，是指在基因组上单个核苷酸的变异而形成的遗传标记，具有密度高，多态性丰富，二等位基因性等特点。在人类基因组中大概每1000个碱基就有一个SNP位点，人类基因组上的SNP总量大约有3×106个，在疾病相关基因的鉴定、药物的设计和测试以及生物学基础研究中，SNP将作为一个强有力的工具。

大量SNP位点的存在，使人们有机会发现与各种疾病相关基因的改变。从实验操作来看，可能通过SNP直接发现疾病相关基因突变；有些SNP的存在并不直接影响疾病基因的表达，但由于它与疾病相关基因位置相邻，而成为重要的标记物。

随着高通量SNP检测技术如KASP的出现，作为数量*多且易于批量检测的多态标记，SNP在连锁分析与基因定位，包括复杂疾病的基因定位、关联分析、个体和群体对环境致病因子与药物的易感性研究中将发挥越来越重要的作用。

二、LGC KASP与SNP研究

基因有限公司代理英国LGC公司的KASP试剂及其SNPline仪器系统，并为客户提供SNP分析的技术服务。

KASP（Kompetitive Allele Specific PCR），即竞争性等位基因特异性PCR，可在广泛的基因组DNA样品中（甚至是一些复杂基因组的DNA样品），对SNPs和特定位点上的InDels(Insertions 和 Deletions，插入和缺失)进行非常准确的双等位基因判定，该实验方法具有高度稳定性和准确性。

KASP技术已有十多年历史，发表文献数超过2000篇，广泛应用于SNP，Indels检测，被众多科研单位采用。

KASP基因分型平台具有：优异的准确性和检测效果、超强的灵活性（引物的设计、实验的设计等）和前所未有的超低成本和技术门槛。

KASP的试剂有两部分组成：

一是引物，含有三种特异性的寡核苷酸链/引物：两种等位基因特异性的正向引物和一种通用的反向引物，其序列通过**的Kraken™软件生成。引物存放于单个带有二维码的试剂管中，便于管理与追踪；

二是Master Mix，包含通用的RET cassette荧光引物，ROX™内参染料，KlearTaq™ DNA 聚合酶，dNTP和MgCl2等组分，已预置于优化的缓冲液中。引物不带荧光标记，所以具有更长的保存期限，便于长久的使用。Master mix为通用试剂，与SNP的位点无关，所有的位点都使用相同的mix，所以具有更大便利性和降低使用成本。

三、LGC KASP在疾病研究中的应用

1）急性粒细胞白血病

中国人群中白血病的发病率大约是十万分之四左右，儿童占约四分之一，其中急性粒细胞白血病（Acute lymphoblasticleukemia，ALL）是主要发病的血液病类型之一，而其中B细胞前体急性粒细胞白血病（BCP-ALL）占这其中70%的比例。如果得到准确的诊断，规范的治疗，ALL的治愈率可以达到80%甚至更高。

英国癌症研究所基于German GWAS研究已经证实7p12.2，9p21.3，10q21.2，14q11.2与BCP-ALL相关。在此基础上他们吸收了前人发表的同类GWAS数据进行Meta分析，联合分析后找出8个SNP位点进入replication验证，使用LGC KASP基因平台进行检测分析，*后找出2个相关的SNP位点，rs10828317和rs3824662，分别影响了PIP4K2A和GATA3基因，都与ALL显著相关。而且后者可以作为生存率的判断指标。详见下图：

 
German GWAS实验路径图

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2）类风湿性关节炎

类风湿性关节炎属于系统性自身免疫疾病。BANK1和BLK都编码B-细胞通路的蛋白，因此归属于自身免疫多效性基因。*近研究发现，BANK1和BLK的基因SNP多态性和表型在SLE疾病中有关联，而BLK也被证明参与了类风湿性关节炎的发生。Emmanuelle Genin,Baptiste Coustet要研究BANK1是否和RA的发生有关，以及BANK1和BLK是否存在上位互作参与RA的发生。

Emmanuelle Genin,Baptiste Coustet等人选取了1454例类风湿性关节炎病人（820例为法国人，634例为日本人），1542位健康人作为对照，针对BANK1的两个SNP位点（rs10516487 and rs3733197）及BLK的SNP位点（rs13277113）进行基因分型，作者采用KASP的技术平台。另外通过之前已经发表过的一些数据，同样是针对这两个基因的3个SNP位点，461例西班牙RA病人及373个健康正常对照的基因分型结果。

研究结果证实了BANK1是类风湿性关节炎的易感基因，并且首次揭示了BANK1与BLK的上位性。研究还阐述了多能性上位相互作用的概念，表明BANK1与BLK在类风湿性关节炎的发病机制中起重要作用。

3）高血压

高血压是目前世界范围*普遍发病的心血管疾病之一，具有发病率高，并伴有家族史等特点。前期研究已经鉴定出47个基因突变与高血压有显著相关性，但总体来说这些只能解释高血压的部分遗传表型。为了发现更多的与高血压相关的遗传座位，Toby Johnson，与Tom R. Gaunt等人采用定制基因芯片技术来进行基因筛选，对25,118名患者与正常人进行基因分型验证，下游实验使用KASP基因分型系统对10个SNP位点来进行鉴定分析。

研究发现这些高血压相关SNP位点与四个基因作为有显著的相关性（NPR3、HFE、NOS3和SOX6）。染色质免疫共沉淀和转录表达的数据表明了MTHFR和NOS3基因的潜在调控机制。这些实验结果为进一步的剖析高血压的形成机制提供了帮助，并且突出了SNP研究的重要性。

4）杜普征氏掌挛缩

杜普征氏掌挛缩是一种手部和指部的良性瘤样纤维组织增生疾病，导致手部和指部的弯曲障碍。Guido H. Dolmans等人通过GWAS分析，对960名患者和3117名正常人进行研究，以筛选出与发病相关的遗传标记物。前期筛选了35个与该病相关的SNP位点，后续又来自德国、英国和荷兰的1365名患者于8445名正常人进行大群体的验证。结果发现3个基因座位中的8个SNP位点与杜普征式掌挛缩症有显著的相关性。共计2325名患者于11,562名正常人的筛选中共发现了位于9个不同基因座位的11个SNP位点与该病的发病相关。而这其中的6个基因座位（WNT4(rs7524102)、SFRP4(rs16879765)、WNT2(rs4730775)、RSPO2 (rs611744)、SULF1 (rs2912522)和WNT7B(rs6519955)）与已知的Wnt信号通路有关。

研究发现了与杜普征氏掌挛缩症相关的易感基因，而这9个基因座位中的6个座位所编码的蛋白又与Wnt信号通路相关，表明了Wnt信号通路的异常与杜普征氏掌挛缩的瘤样纤维组织增生性状具有显著的相关性。

四、进行中的大型国际性合作项目

1）TrackingParkinson’s
Tracking Parkinson’s是英国帕金森疾病研究组织的项目，通过征集全世界2,240名帕金森患者，该项目将成为全世界*大*深入的帕金森疾病研究项目，目的是通过研究发现与帕金森发病相关的生物标记物。该项目不仅为个体帕金森疾病的初步诊断提供帮助，也为疾病的新疗法提供发展方向。
LGC集团作为Parkinson’s UK合作方，为帕金森的分子诊断提供技术与平台的支持。
链接：http://www.parkinsons.org.uk/content/tracking-parkinsons

2）GEFOS
GEFOS是GEnetic Factors for OSteoporosis Consortium的简称，是一个国际性的骨质疏松基因遗传研究的组织。GEFOS项目旨在通过利用先进的基因分型检测系统，如高密度SNP基因芯片等技术，来鉴定与骨质疏松有关的遗传突变。LGC集团将为该项目的85,000份DNA样本、85个SNP位点的鉴定提供服务。
链接：http://www.gefos.org/

3）EPIGEN
EPIGEN组织采用流行病学调查和宿主病原体基因组研究来了解衣原体疾病，旨在通过了解衣原体感染宿主的遗传易感性和感染宿主的遗传鉴定，以提高生育力低下鉴定的能力。
LGC集团将为该项目的15,450份样本进行核酸抽提和SNP鉴定服务。
链接：http://www.epigenchlamydia.eu

4）Whitehall II
Whitehall II项目是一个英国的研究组织，成立于1985年，旨在研究不同阶层人员的健康状况，评估经济状况对健康的影响。
LGC集团为该项目的10,000样本提供核酸抽提和SNP分型的服务。
链接：http://www.ucl.ac.uk/whitehallII

LGC公司KASP基因分型技术，作为一种简便、灵活、高通量的基因分型技术/平台，可以为各种临床疾病的研究、分子诊断标志物的开发、临床诊断、个体化用药、疾病预后研究等提供强有力的技术支持。

作为中国独家代理商，基因有限公司为您提供*合适的仪器，试剂或技术服务方案，欢迎您向基因有限公司公司垂询。我想了解KASP的仪器，试剂或技术服务方案