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Western Blot实验操作进阶技巧

【字体: www.ebiotrade.com 时间:2015年5月8日 来源:生物通

摘要:

  近年来Western blot技术也有了一些发展,一些新的试剂和仪器令Western更为敏感,一些主要步骤(电源,转膜等)也更为精简,虽然许多研究人员仍然使用的是化学发光法检测法和X光胶片,但一些新的技术,如数字荧光成像技术已经提高了这种工具的敏感性和可靠性,令其进入了“定量时代”。一些新的技术方法也能令Western blot可以用于单细胞检测,或者对有限及珍贵的样品进行检测,其中的一些步骤也实现的自动化。

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——小叮当口袋里的各种法宝令Western blots操作更快,更敏感,也更可靠

生物通报道:除非是Western blot实验方面的高手,要不就像在我看来,Western blot发展至今好像与其1979年刚被发明出来的时候一样一样,同样也是根据蛋白不同的大小(或电荷)进行电泳分离,然后转膜,利用抗体筛选出目标蛋白。

多年来这种技术已经成为了蛋白研究方面的一种主要技术,研究人员可以利用Western blot定性,甚至半定量的识别组织和培养细胞中的蛋白,这种操作实验可以说每天都会在实验室里上演,但同时,Western blot等blot技术也是各种审议的主题,学术造假,以及一些研究成果被退回的原因。

近年来Western blot技术也有了一些发展,一些新的试剂和仪器令Western更为敏感,一些主要步骤(电源,转膜等)也更为精简,虽然许多研究人员仍然使用的是化学发光法检测法和X光胶片,但一些新的技术,如数字荧光成像技术已经提高了这种工具的敏感性和可靠性,令其进入了“定量时代”。一些新的技术方法也能令Western blot可以用于单细胞检测,或者对有限及珍贵的样品进行检测,其中的一些步骤也实现的自动化。

减少样品量

过去几年里,研究人员已经迈出了检测单个细胞中DNA 和 RNA的重要一步,相比之下,蛋白检测已经落在后面。蛋白抗体质量不过关是主要的原因,这限制了研究人员在使用流式细胞仪和免疫细胞化学方法进行单细胞蛋白水平检测的精确度。而且Western blot实验需要分离得到蛋白,然而迄今为止这在单细胞中还无法做到。

来自加州大学伯克利分校的生物工程研究组Amy Herr等人研发出了一种新型的微流控设备:scWestern (即single-cell Western),这种设备可以帮助研究人员在四小时内完成大约2000 个体细胞的Western实验。

从结构上来说,scWestern 包被有30-μm厚的光敏聚丙烯酰胺(PA)凝胶,而芯片上共有6720个微孔。这些微孔的直径为20 μm,是在聚丙烯酰胺凝胶聚合时形成的。

从设计原理上来说,scWestern实现了高度平行的分析,而不需要单独获取每个细胞。通过被动重力驱动的细胞设置,细胞悬液接种到微孔中,每个微孔在5-10分钟内捕获0-4个细胞。而且研究人员通过优化短分离距离的聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE),实现了高密度的scWestern芯片。在细胞裂解后电泳开始,他们在浸没的scWestern玻片上应用电场,电泳蛋白穿过微孔壁,进入薄的凝胶层。其次这一设备利用了反应(蛋白质固定)和运输(抗体杂交)的小特征长度。在PAGE之后,蛋白质与PA凝胶交联。之后进行抗体杂交和检测。

研究人员应用这种方法来研究体外刺激下的干细胞信号和分化反应,结果发现scWestern能定量每个单细胞中最多11种目标蛋白,在与FACS整合时,支持稀有或珍贵细胞(~200个)的分析。

如何入门:

虽然这项技术是全新的,但是一般来说通过多次练习,刚毕业的学生在一个月内就能掌握这种技术,Herr说。

同时Herr也与Zephyrus Bioscience公司合作,计划于明年推出相关的自动化设备。

注意事项:

不过需要注意的是这种技术有两个限制。其一是细胞裂解后,蛋白会从微孔中漏出,造成高达40%的损失。其次是分离度欠佳,研究人员无法区分质量相差至少一半的蛋白。Herr研究组目前正努力解决这两个问题,“我想我们已经有了一些令人高兴的结果,”她说。

微western芯片分析技术(Microwestern,生物通注),比如Herr的“μWesterns”(scWestern之前的一个成果,比scWestern孔径大)则能帮助那些进行细胞群体研究,而不是单细胞研究的研究人员,这种方法是在一个96孔板上将细胞裂解液放到96个微小的凝胶块中,具体过程可以通过YouTube视频来看(www.igsb.org/services/mwac-methodology)。微western芯片分析能区分质量相差75kD的蛋白(蛋白质量超过200kD),同样也需要piezoelectric dispenser,而这并不便宜。

费用:

相关仪器的价格待定,如果你需要制造自己的 scWestern,那么就需要花费几千美元(其它材料准备充分),而微western芯片的价格则为每次1,800美元(当地价格)——96个抗体检测六种细胞裂解液。

 

实验操作加速

从开始到结束,传统的Western blot操作需要大约两天半的时间,如果还要重做,加上样品量很大的时候,真是会让人崩溃。“我要做许多WB实验,检测所有的样品,这真是费时费力,”来自加州大学旧金山分校的博士后研究员Jillian Silva说。

为此Silva修改了Western blot的实验操作流程,让时间缩短到一天完成。首先她将SDS-PAGE 凝胶换成了Bis-Tris 系统,这样跑胶的时间就缩短到了35分钟(而PAGE胶需要1.5-2个小时),并且这一系统也能提高检测的灵敏度。其次Silva购买了一套新的blotting系统,也就是 iBlot 系统——能在7分钟内完成转膜,而传统方法需要1-2个小时。(大家可以 在此处咨询相关国内技术人员 >> >>)

第三,也就是最重要的一点,她采用了不同于传统化学检测方法的荧光检测方法:LI-COR的 Odyssey系列产品,这一系统采用近红外荧光技术,降低背景荧光,提供比可见光谱荧光更高的信噪比,且灵敏度与化学发光相当,而且升级后的Odyssey增添了自动扫描功能,无需摸索激光强度。

欢迎索取Odyssey检测系统的详细资料

从使用感受上来说,Silva说这一系统有两个激发波长:700nm和800nm,所以可以在同一个膜上检测两种不同的蛋白,“这一点用处很大,因为这样我就能同时跑两种不同蛋白了,”她说。

如何入门:

Silva 和其他几个实验室共享了她的实验操作方法,一些实验室也发表了相关的论文(the Journal of Visualized Experiments ,e51149, 2014),刚开始他们还有些犹豫,不想采用荧光检测的方法,但是一旦开始用上了这种方法,就会爱不释手了。不过在最开始上手的时候,还需要一些调整,如缓冲液的用量,抗体温孵的时间等,她表示这些都有助于提高速度和灵敏度。

费用:

每个Bis-Tris 胶为 14.50美元(当地价格),iBlot 2 Gel Transfer Device设备为1,996美元(当地价格),LI-COR Odyssey Infrared Imaging System价格为3-6万美元(当地价格),国内价格请具体询问各厂家。在此处咨询相关价格>> >>

注意事项:

时间节省来自于成本的增加,Silva 估价称大约每次实验要多花费20美元(当地价格),但是如果考虑到人员成本、动物维护费用等等的时间和精力,而且荧光成像无需化学显影,定影等相关的费用(在Silva的实验室这个花费约为324 美元/年),Silva觉得还是划得来的。


总蛋白内参

研究人员为了能定量分析目标蛋白,一般来说都会将其与溶液中的其它单一蛋白进行比对,如GADPH、 β-肌动蛋白或微管蛋白等,这些蛋白的表达水平量一般认为是维持不变的。

但是近年来的研究表明,这些所谓的上样内参在同一组织的不用位置,以及出现疾病的情况下也会发生变化,而且差异可以高达20%(PLOS ONE,8:e72457,2013年)。在这篇文章中,研究人员检索了已发表的芯片数据和质谱数据,发现常用的细胞骨架蛋白(actin,actinin和各种tubulin异构体)、线粒体蛋白(VDAC1和VDAC2)和细胞核蛋白(HC1)都存在差异表达。

“许多大家用作上样内参的蛋白……其实并不稳定,它们在许多不同的神经退行性疾病情况下都发生了改变,”来自英国爱丁堡大学罗斯林研究所研究员Thomas Wishart说。

为此,Wishart研究组修改了传统的方法,将他们的目标蛋白与同样条道的总蛋白水平进行比对,结果发现这是更为可靠的一种方法。首先研究人员同时跑两块胶,并将其中的一块用考马斯亮蓝染料浸泡。然后他们通过数字图像处理软件,检测整条道中的蛋白信号。

(研究人员发现作为对照的单个看家蛋白实际上也会发生变化,因此分析样品中的总蛋白浓度(黄色框标识)是定量蛋白的更好内参)

如何入门:

Wishart的方法,以及相关的故障排除Tips都发表在了一篇论文中:A Guide to Modern Quantitative Fluorescent Western Blotting with Troubleshooting Strategies。Wishart说,当然多跑一块胶会导致其它问题的出现,但只要你上样单μL的量,那就不成问题。这种方法还能通过BCA或者其它蛋白检测方法分析蛋白浓度,交叉检查考马斯亮蓝染色结果。

费用:

Wishart的方法会增加实验成本,跑胶,染色大约会增加20%的成本,但是“实际上从长远来看这能节约钱,因为你从一开始就不会做错,不用重来,”他说。

注意事项:

如果你还是希望用单个蛋白作为内参,那么可以找一下蛋白质组的数据(质谱数据),看看有哪些蛋白水平变化小,更为可靠一些。

傻瓜Western blot操作系统

Western blot技术发展至今,其繁琐的步骤其实并没有多大变化,虽然通过一些科学家们的优化,这些步骤有了些变化,但手工步骤越多,出错的几率也越大。因此研究人员希望能自动化这一过程。

美国加州的一家公司:ProteinSimple 推出了一种与众不同的Western blot操作系统,这一系统采用基质填充毛细管电泳,替代传统的凝胶,研究人员只需将样品、一抗、二抗和检测试剂加入微孔板,按下Start就行了,几个小时后就能得到完全分析好的数据了。

2011年,该公司推出了第一台傻瓜Western blot操作系统:Simon,2014年,ProteinSimple又推出的全新的仪器——Wes,这台仪器能在不到3个小时内完成25个样品的分析,此外还有另外两台名为Sally Sue 和 Peggy Su的高通量仪器,这两台仪器每次能分析96个样品,上样量仅需0.2 μg/μ L 裂解液。

“除了提升了实验的可重复性和结果一致性,这一系统最大的优点在于能分析数量十分有限的样品,”来自斯坦福大学医学院的Joanna Liliental说,她的实验室采用了Peggy Sue,以及电荷分离 NanoPro 1000,“电荷分离分析依赖于细胞中靶标蛋白的丰度,这种技术能定量仅仅25个细胞中的蛋白信号,标准Western是不可能完成这样的实验。”

费用:

Wes的定价标准定位于“高端成像系统”,Simple Western产品总监Patricia Piatti说,这一系统的耗材要比传统Wsetern更贵,但平均成本差不多,Piatti表示。

如何入门:

Simple Western的仪器需要添加一些内核,同时仪器使用也需要培训,一般来说要培训四个小时,并且在几个星期的使用后才能流畅操作这些仪器,而且软件使用也要花时间掌握。

注意事项:

与任何Western Blot实验一样,抗体质量是一个限制因素。ProteinSimple 和它的姊妹公司Bio-Techne 正在尝试验证那些能用于仪器的抗体,“这是一个正在进行的项目,我们将会在已有的抗体列表中添加上新的内容,”Piatti说。

生物通:张迪)

(http://www.ebiotrade.com/)
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