用CRISPR/Cas9领略不一样的风景

生物通报道：CRISPR/Cas9基因组编辑技术给分子生物学领域带来了一场变革。研究者们只需使用细菌核酸酶Cas9和引导酶切位点的短RNA，就能够在活体生物中有效敲除或者改变基因序列。

CRISPR/Cas9系统原本是细菌的一种适应性免疫，不过人们发现它能作用于多种生物，从致病菌、植物到灵长类动物。目前绝大多数CRISPR研究是在动物系统中进行的，但研究证明CRISPR/Cas9也可以在拟南芥、烟草、高粱、水稻和小麦中介导突变生成。这个强大的技术既可用于双子叶植物也可用于单子叶植物。

与如火如荼的动物研究相比，植物CRISPR研究是一个比较冷门的方向。这就像是一块没有被完全开发的景点，走进去往往可以领略到不一样的风景。那么，假如我们涉足这一领域需要注意哪些主要的问题呢？

核酸递送

在CRISPR/Cas9系统中，核酸酶根据RNA的指引在自定义位点上切割DNA。细胞会通过非同源性末端接合（NHEJ）或者同源重组修复（HDR）来修复这样的损伤。NHEJ会引入移码突变，一般用来进行基因敲除。HDR可以根据模板DNA进行修复，一般用于校正突变或者插入报告基因。不过需要注意的是，NHEJ发生的频率比HDR高，往往需要进行大量的筛选才能找到正确修复的克隆。

CRISPR/Cas9在不同生物中的基因组编辑过程是大同小异的。不过植物研究面临着一些特殊的问题，比如核酸递送，明尼苏达大学基因组工程中心的主管Dan Voytas说。他也是Calyxt公司的科技总监，该公司主要是为农业应用开发基因组工程技术。

“你需要将DNA引入细胞或者组织，然后让其长成完整的植株，”Voytas说。

虽然核酸递送在有些植物（比如土豆、烟草和油菜）中相对比较容易，但其他植物的核酸递送是相当困难的，Voytas解释道。因为细胞壁的存在，适用于哺乳动物细胞的DNA递送机制（比如电穿孔和脂质转染）难以作用于天然的植物细胞。

植株再生

DNA递送成功之后，研究者们还需要鉴定正确修饰的细胞，并让其生长成完整植株。而植株再生（相当于从胚胎获得转基因小鼠）是一个相当耗费时间的麻烦过程。

“用哺乳动物细胞，我们两三天就能做一次验证实验。但植物研究要困难得多，” Sigma-Aldrich公司的首席研发科学家Fuqiang Chen说。“植物生长周期长，转化效率低，而且实验方案也并不容易。”

 

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Voytas和同事最近用TALEN技术改良了土豆对冷藏的耐受性。他们首先生成原生质体，然后向其中引入编码TALEN蛋白的质粒，并使其长成完整植株。他们经过12周到几个月的时间才得到可以收获嫩枝的植株，这些植株随后需要转移到生根培养基中以便继续生长。

大规模筛选

因为人们对转基因作物的担忧，植物研究者很少使用选择性标记，这也是个大问题。植物CRISPR研究大多采用瞬时表达，在数百个生物体中筛选成功的转化株。举例来说，Voytas等人在土豆研究中筛选了六百个嫩枝，找出五个符合要求的转化株。

当然，基因组编辑技术在植物研究中也有显著的优势，比如说可以靶标多个等位基因。哺乳动物是双倍体，需要敲除两个拷贝的基因。植物大多是多倍体，一个基因有多个拷贝，而基因组编辑工具可以很容易地将其全部敲除。Voytas靶标的土豆基因有四个拷贝。另外，还有研究者用CRISPR/Cas9和TALEN制造抗白粉病的小麦，成功敲除了六个等位基因。（延伸阅读：Nature子刊：中科院利用CRISPR及TALEN技术获基因组编辑新突破）

可以选择的工具

假如你对植物CRISPR研究感兴趣，市面上可供选择的工具其实并不少。Addgen、安捷伦、Clontech、GE Dharmacon、Horizon Discovery、Origene、Sigma-Aldrich、赛默飞世尔等公司都有这样的试剂。

举例来说，Sigma-Aldrich公司提供有一系列CRISPR/Cas9质粒、纯RNA、慢病毒颗粒和CRISPR文库、载体和递送系统。安捷伦公司推出了纯化的Cas9蛋白以及引导RNA转录试剂盒（大多用于体外实验）。GE Dharmacon的CRISPR RNA configurator程序可以直观的设计crRNA，研究者们只需要简单输入目的基因。

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此外，你还可以从非赢利的Addgene获得大量的CRISPR工具。2014年六月PLOS Biology上的一篇文章显示，Addgene收藏有“44个不同实验室的400个质粒”。据Addgene的Joanne Kamens介绍，在那之后Addgene的CRISPR目录已经增长到了50个实验室的上千种试剂，包括已验证的引导RNA，用于引导RNA克隆的空载体，和Cas9表达质粒。值得注意的是，Addgene的收藏中包括有8个实验室的32种植物特异性质粒。

美国用户只需要$65（单价）就可以获得Addgene的试剂，因此CRISPR/Cas9实验的门槛其实是很低的。不过核酸递送仍旧是个大问题，Voytas指出。他建议研究者们多花时间在培养基和实验方案的开发和优化上。毕竟如果不能成功递送，再好的质粒也是白搭。

参考文献：

 [1] Lozano-Juste, J, Cutler, SR, “Plant genome engineering in full bloom,” Trends Plant Sci, 19:284-7, 2014. [PubMed ID: 24674878]

[2] Belhaj, K, et al., “Plant genome editing made easy: Targeted mutagenesis in model and crop plants using the CRISPR/Cas system,” Plant Methods, 9:39, 2013. [PubMed ID: 24112467]

[3] Clasen, BM, et al., “Improving cold storage and processing traits in potato through targeted gene knockout,” Plant Biotechnol J, 2015. doi:10.1111/pbi.12370. [PubMed ID: 25846201]

[4] Wang, Y, et al., “Simultaneous editing of three homoeoalleles in hexaploid bread wheat confers heritable resistance to powdery mildew,” Nat Biotechnol, 32:947-51, 2014. [PubMed ID: 25038773]

[5] Kamens, J, “Addgene: Making materials sharing ‘science as usual,’” PLOS Biol, 12:e1001991, 2014. [PubMed ID: 25387006]

[6] Xing, HL, et al., “A CRISPR/Cas9 toolkit for multiplex genome editing in plants,” BMC Plant Biology, 14:327, 2014. [PubMed ID: 25432517]

 

（Jeffrey M. Perkel撰写/叶予编译）