与CRISPR旗鼓相当的新一代RNAi

【字体: www.ebiotrade.com 时间:2015年6月17日 来源:生物通

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  此前,加州大学旧金山分校的研究团队通过建立超复杂混合shRNA文库,在很大程度上克服了RNAi用于全基因组筛选时的脱靶效应。现在他们通过系统改良进一步增强了shRNA的活性,向人们展示了靶标人类和小鼠基因组的新一代shRNA文库。这一成果发表在近期的美国国家科学院院刊PNAS杂志上。

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生物通报道:基因筛选是经典的生物学研究方法,可以鉴定在某一生物学过程中起作用的基因。哺乳动物细胞的基因筛选一般是在RNA干扰(RNAi)的基础上进行的。

1998Andrew Fire Craig Mello两位科学家首次在线虫中证明了RNAi的存在,他们也因此获得了诺贝尔生理/医学奖。2001年马普研究所的科学家们又在哺乳动物中发现了RNAi特异性沉默机制。这一技术随即成为了反向遗传学的重要工具,被视为靶向任何基因的“神奇子弹”。

RNAi是通过引入siRNA或者shRNA,让细胞降解相应的mRNA,通过功能缺失表型来进行基因筛选。不过RNAi比较容易出现错误,siRNA/shRNA的脱靶效应会引起假阳性结果,siRNA/shRNA缺乏活性会引起假阴性结果。

此前,加州大学旧金山分校的研究团队通过建立超复杂混合shRNA文库(ultracomplex pooled short-hairpin RNA libraries),在很大程度上克服了RNAi用于全基因组筛选时的脱靶效应。现在他们通过系统改良进一步增强了shRNA的活性,向人们展示了靶标人类和小鼠基因组的新一代shRNA文库。这一成果发表在近期的美国国家科学院院刊PNAS杂志上,文章的资深作者是加州大学旧金山分校的Jonathan S. WeissmanMartin Kampmann

Weissman等人之前还开发过基于CRISPR的基因筛选技术,称为CRISPR干扰(CRISPRi)。CRISPR原本是细菌抵御病毒的重要武器,现在它已经成为了科学研究的强大工具。虽然CRISPRi在哺乳动物细胞中有很大的应用潜力,但在某些情况下RNAi筛选依然是研究者们的首选。(延伸阅读:Cell重要成果:基因表达沉默新技术

在这项研究中,研究人员对自己的shRNA文库进行了多方面的优化,包括向导链的选择以及shRNA表达的启动子和microRNA环境。他们还考虑到了筛选后的样本制备,以便进行深度测序。研究人员建立了靶向人类和小鼠蛋白编码基因的新一代文库,并根据生物学功能将其分为12个亚文库。  

                               立即索取Life Tech CRISPR载体的最新资料

研究表明,新一代RNAi文库在测试中的表现与CRISPRi旗鼓相当,能够获得高灵敏度和高特异性的互补性结果。

 

生物通编辑:叶予

生物通推荐原文:Next-generation libraries for robust RNA interference-based genome-wide screens

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