2015流式细胞技术新技巧Tips汇总

【字体: 时间:2015年06月29日 来源:生物通

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  “在大部分情况下,如果你的亲和检测过程没问题,也就是抗体或低聚物探针能特异性的标识靶细胞类型,那么流式细胞仪还是很好用的,”加州大学旧金山分校助理教授Adam Abate说,“而这实际上并不是我们经常想要做的方向。”

——新型流式细胞设备能帮助研究人员发现更多新的途径计数和分类单个细胞

生物通报道:最初作为一种免疫学和细胞生物学研究工具的流式细胞技术,在经过几十年的洗礼之后,已经愈发强大,能帮助使用者们进行单个细胞内多种分子和物理特征的归类,而相关的荧光激活细胞分选仪(fluorescence-activated cell sorter,FACS)则更是能帮助研究人员从异质的多种细胞中筛选出特殊细胞来。

这些设备工具对生物学研究产生了深远的影响,但是它们还是存在一些局限性,比如有时这些技术只能基于蛋白含量来计数或分选细胞。因此要利用这些方法识别包含特殊突变的细胞,并不容易。而且研究人员也需要事先知晓他们寻找的是什么分子,才能用于荧光标记抗体靶向靶标。同时由于流式细胞技术也取决于表面受体结合的抗体,因此总是存在实验本身激活或改变分析细胞的可能性。

“在大部分情况下,如果你的亲和检测过程没问题,也就是抗体或低聚物探针能特异性的标识靶细胞类型,那么流式细胞仪还是很好用的,”加州大学旧金山分校助理教授Adam Abate说,“而这实际上并不是我们经常想要做的方向。”

因此近年来,科学家们研发出了一些新的策略,但他们并没有修改传统的流式细胞仪,而是在新型微流控装置上进行精简。这些微型芯片实验室能帮助研究人员在更为多样的物理和分子特征基础上进行筛选和分型,而且也不需要抗体。以下是几位学者提出的新型流失细胞技术与研究策略。

磁计数

来自哈佛医学院放射科的助理教授Hakho Lee等人研发出了一种高灵敏的新型全血内稀有细胞检测技术,这种技术的独特性在于具有磁化特性和生物正交化学特性的磁性纳米粒子,非常适合在临床实践中进行稀有细胞的分子和细胞诊断。

检测稀有细胞(<100个细胞/毫升全血),并对单细胞特异性标志物进行定量测量的能力在基础生物医学研究中日益重要。然而,细胞密度低,样本量小,以及需要对样品进行必要的净化等限制因素阻碍了这种方法在临床的广泛使用。

为了克服这些挑战,Lee等人构建了一个以微量流体芯片为基础的微型霍尔探测器(μHD),它可以在全血中直接测量单个的,免疫磁性标记细胞。 μHD甚至可以在广大的血细胞和未结合反应物存在下,检测单个细胞,而不需要任何清洗或纯化步骤。

此外,用于μHD的半导体技术具有高灵敏度和测量的广谱性。这使它可以进行高通量的筛选(目前约1千万个细胞/分钟)。对20个卵巢癌患者全血使用μHD芯片检测循环肿瘤细胞证明,该方法的灵敏度远高于目前临床标准的要求。

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PCR+流式分析

研究人员:加州大学旧金山分校生物工程与治疗生物学助理教授Adam Abate

当前项目:分析罕见的自养型微生物

存在问题:针对无法培养细菌的特殊抗体

解决方案:

Abate在哈佛大学工程与应用科学学院的著名教授David A. Weitz实验室从事博士后研究工作,后者是国际上生物物理与生物材料、微流控等研究领域的知名专家。

Abate与其他研究人员一道开发出了一种新型设备,可以根据液滴的荧光强度来进行分拣。这种方法与传统的微流体不同,液滴设备能通过油环境的均匀墨滴水溶液反应室包裹分子或细胞,而传统方法则是让分子和细胞裸露的通过通道。

为了解决自养无法培养的微生物问题,Abate采用了这种基于细胞遗传特性的方法来分拣,研究人员将这个过程称为“基因组流式细胞术”。

Abate解释道,微生物学家常常希望能够根据特殊的技能群区分细胞,比如能代谢高氯酸盐的细胞,后者是一种环境污染物。但要找出这些细胞来并不容易,“用传统的流式细胞仪,几乎不可能根据细胞核酸组成来进行分类,”他说,反而是PCR,“能进行细节扩增,你要做的就是改变引物和探针,从而能找到靶标细胞。”

由此Abate提出了PCR激活细胞分拣方法:PACS(PCR-activated cell sorting)。每个液滴都包含有一个单细胞,PCR试剂,靶向靶标序列的引物,以及一个荧光TaqMan探针。成功扩增细胞中的DNA,就能得到一个荧光信号,然后通过激光微流控电路进行检测,由此来分拣。

近期Abate也发表了这样的一篇论文,对大肠杆菌进行了分拣,这些细菌有的能合成TolA蛋白,有的不能。(PLOS ONE,10:e0113549,2015年)

PCR+FACS系统如何尝试:

Abate说,研究人员可以重复他的芯片设计,但他们还需要显微镜、软件、激光器和电子运转器,这一套算下来大约为4万美元(当地价格)。比较简单的方法就是构建PCR液滴乳液,在FACS中进行分拣(Lab Chip,13:4563-72,2013年)。

“目前市场上有droplet generators,”Abate说,但还是需要获得乳液,如Dolomite Microfluidics。“FACS无法在油环境下工作,它需要油滴包裹水滴,悬浮在水中,对于流式细胞仪来说,这就像一个细胞。”

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RT-DC甩开标记

研究人员:来自德国德累斯顿工业大学的Jochen Guck教授

当前项目: 癌细胞分型

存在问题: 并不是每种细胞类型都已有能识别的抗原,而且结合抗体也许会激活受体,潜在改变细胞行为。

解决方案:

Guck教授此前的专业是物理学,在其研究生阶段,曾利用激光束分析细胞的物理特性,他发现并不是所有的细胞都是黏糊状,相比于正常健康细胞的韧性,癌细胞更为柔软。

“侵袭性越强的细胞,越柔软,这可能是其进入组织的一个必要条件,”Guck解释道。

Guck认为这也许能被用于分型,也就是说无需抗体进行相同细胞的筛选,一些目标细胞类型和癌细胞并没有独特的分子标记,但是变形能力是一种细胞的“内在特性”,能用于无标记细胞分析,“细胞虽然不能帮助我们,但是它们具有自己的特性。”

由此Guck等人研发出了一种新方法,称为变形度流式细胞技术(deformability cytometry,DC,生物通译),这种技术能对大量细胞(>100,000个细胞)进行持续快速的细胞机械力分析。在此技术上,Guck又进行了拓展,推出了实时变形度流式细胞技术(RT-DC),研究显示,RT-DC比之前的机械力分析技术快一万倍,每秒可分析超过100个细胞。这种无标记的分析方法为流式细胞分析添加了新的维度,有着广阔的应用前景。

RT-DC能在几分钟之内,获得一滴血里不同细胞类型的机械力指纹。血液中的白细胞数量远远不及红细胞,二者比例大约为1:1000。不过由于RT-DC通量很高,该技术的白细胞检测是很可靠的。白细胞是免疫系统的重要部分,其机械力指纹的改变可以帮助医生更快更好的评估患者的健康。

DIY:

复制RT-DC设备是可行的,但是这并不简单,Guck说,“你需要一个实验操作十分熟练的博士后,”而且芯片、相机、运算算法和注射泵需要组装和操作也费时费力,他预计大约的花费成本为“10万欧元,包括显微镜”。Guck研究组成员正在组建一个公司:ZellMechanik Dresden,希望能将这一技术商业化。

SmartRNAplex™ miRNA-基于流式平台进行多重miRNA检测新技术

单细胞拉曼分选

研究人员:中科院青岛生物能源与过程研究所单细胞研究中心主任徐健研究员

当前项目: 微生物生物燃料发展

存在问题: 生物燃料研发需要标识出那些能进行特殊碳化学反应的细胞,但是这些细胞无法正常培养和研究,因此研究人员也不清楚是否有一些能识别和分拣细胞的分子标记。

解决方案:

徐健研究组以单细胞拉曼分选(RACS)为基础,研发出了一种基于阵列介电单细胞捕获/释放的快速拉曼识别技术。

单细胞拉曼分选(RACS)是一种极具潜力的活体细胞功能分选技术。与目前通用的荧光激活细胞分选(FACS)相比,RACS具有直接基于细胞功能分选、无需标记、不需预知生物标识物的关键优势,因此在海洋资源挖掘、生物能源种质筛选、肿瘤监测与分选、环境微生物监控、农业生态研究等诸多领域具有广阔应用前景。但由于细胞固有拉曼信号弱所导致的细胞分选通量低这一问题限制了其应用与推广。开发高速流动细胞拉曼信号的快速采集和识别已经成为发展高通量拉曼流式细胞分选的关键技术挑战之一。

为此,这一研究组开发了一种基于阵列介电单细胞捕获/释放的快速拉曼识别技术。通过对高速流动单细胞的介电操控,实现了单细胞流在电极上的捕获/释放,并在细胞捕获期间(毫秒-秒)完成拉曼信号的采集识别。

通过耦合该团队同期建立的基于电磁阀吸吮的微流控细胞分离技术(Zhang Q, et al., Lab on a Chip 2014, Cover page, 2014 HOT Articles;下图B),实现了产色素工程酵母和普通酵母细胞的拉曼流式分选。前述工作首次建立起基于介电单细胞捕获/释放的单细胞拉曼流式分选原理和装置,为下一步发展高通量拉曼流式细胞分选仪器奠定了原理和关键技术基础。

单细胞中心前期建立的单细胞弹射分选方法(Wang Y, et al, Anal Chem, 2013)适用于贴壁生长的细胞、微生物生物膜等固相细胞的分选。而该研究开发的单细胞流式分选方法针对于流动相细胞的分选。这两种方法学的建立和相互结合,为研制广谱性适用于自然界各种细胞存在状态的单细胞拉曼分选装备提供了可行性。

如何入手:

徐健研究员表示,在国内已经配置了两台微流控RAC系统,同时还有另外两台正在组装中。第三台RAC系统在牛津大学,研究人员可以申请使用这些仪器,他表示,“欢迎提出任何问题,我们的一些资助资金也鼓励项目合作。”
 

(生物通)

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