常温才是常道:生物样品的常温保存

【字体: 时间:2015年07月01日 来源:上海伯豪生物

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  高质量的生物样品是组学研究和个性化医疗过程中临床检验顺利实施的前提。生物样品的保存方式关系到待检样品的质量和检测的结果。样品的适当的处理、保存方式是最终获取准确测定结果必不可少的一环。常温保存能耗少,环保,效费比较高,是一种有潜力的生物样品保存方式。

生命科学领域高通量技术的发展促进了诸如基因组、转录组、蛋白组以及代谢组等各类组学的研究。相应地,为了客观、全面、完整地反映核酸、蛋白、代谢分子等研究对象各自的量以及彼此之间的相互关系,获得高质量的生物样品是非常必要的。高质量的生物样品是组学研究和个性化医疗过程中临床检验顺利实施的前提。上海伯豪生物在多年提供组学研究技术服务的过程中,常常遇到样品质检不过关的事例。不适当的样品处理、保存和管理方式带来的结果有时是灾难性的。对生物样品的精准采集、正确标记很重要。除此之外,样品的适当的处理、保存方式也是最终获取准确测定结果必不可少的一环。

谈起生物样品的保存,人们往往联想到低温。但生物样品在常温下,通过采取适当的方式,也是可以保存较长时间的。常温保存能耗少,环保,效费比较高,是一种有潜力的生物样品保存方式。本文主要谈谈生物样品的常温保存。

一、 生物样品常温保存的几种方式

目前生物样品的常温保存主要有以下四种方式。

1.福尔马林固定石蜡包埋(formalin-fixed paraffin embedded, FFPE)是对动物组织及其所包含的生物大分子进行常温保存的较常用的方法。福尔马林的有效成分甲醛含有羰基基团,极性较强,化学与生物学活性强。它可使生物大分子发生交联,加上后续的脱水步骤,整个过程破坏了引起核酸和蛋白等大分子降解的酶类的活性,因而被包埋的组织可以在常温下保存。FFPE处理的样品组织与细胞的形态学保持效果很好,多用于医疗机构的组织病理学诊断和免疫组织化学检测。在研究中也用于显色原位杂交或荧光原位杂交。 FFPE包块在常温下可长时间保存,有的数十年后仍有使用价值。用这种方法保存核酸,得率不高,且片段化和交联现象较严重。收获的DNA一般长度不多于400bp,RNA长度不多于200bp。但也能满足某些PCR、RT PCR或基因芯片杂交的要求。

由于福尔马林有致癌性,且容易使核酸片段化,人们开发出一些福尔马林替代物用于组织的固定。经这些替代物固定后石蜡包埋的组织,收获的核酸长度可达数千bp。

2.用稳定液对组织及核酸进行常温保存。这是一种简便易行的生物样品处理和保存方式,特别适用于动物组织样品的短期处置。一些硫酸盐类,在由缓冲剂调节的适当的pH值范围内,可使某些核酸酶活性降低或丧失,从而保护大分子不被降解。这类稳定液,可以迅速渗透组织和细胞,抑制核酸酶活性。将切下来的组织迅速切成尺寸不大于0.5cm的小块,没入5-10倍的稳定液中。对于RNA来说,样品可置于室温(25℃)保存一周,4℃保存一月,-20℃长期保存。当需要分离核酸时,将组织从稳定液中取出,按常规进行后续操作即可。上海伯豪生物技术有限公司开发出的RNAsafety™组织RNA保存液,可用于这种类型的保存。实验显示,它对组织中RNA的保护效果明显(见图1 )。采用RNAsafety™这类稳定液,无需采用液氮或干冰转送和运输组织,便于操作,也节省材料费和运输费。是值得采用的一种样品处理和保存方式。

图1. 用上海伯豪的RNAsafety™组织保存液保存大鼠肝脏组织(蓝、红、绿表示三个复本)。室温放置两周时,指示RNA完整性的RIN值仍在合格线(红线)以上。

3. 采用干式化学稳定基质(包括高分子基质)也可以保存核酸。FTA (Flinders Technology Associates)滤纸保存是其中的一种方式。FTA滤纸是一种多孔的纤维素基质,经由尿酸、非离子表面活性剂或强力变性剂以及螯合剂浸泡处理。当样品加到滤纸上时,细胞被裂解,核酸被释放出来,吸附在滤纸上。滤纸上的化学物质可使蛋白变性,酶活性丧失。载有核酸的FTA滤纸经干燥,可以常温保存核酸长达数年。目前FTA滤纸只可用于常温保存DNA。

还有其它形式的干式保存基质。它们由专利配方的、不同的化学物质组合而成,可提供一种微环境,保护核酸不被氧化、水解或酶解,或者将核酸与热源、紫外线隔离。这类基质通常置于微孔板孔内或试管内。适量加入已抽提纯化好的核酸样品,样品吸附在基质上,干燥后可常温保存。这种方法,只可分别保存DNA 或RNA,不宜将二者同时保存。椐推算,这类基质可将核酸保存十多年。

4.将生物样品冷冻干燥然后进行常温保存。水分是降解酶类作用的条件之一。冻干可去除样品中的水分,因而抑制酶的作用。冻干机通过制冷功能将样品细胞间和细胞内的水冻成冰,通过抽真空和升温将冰升华,进一步提高温度除去残留的与组织或细胞结合的水分子。为了防止冻干品再次吸收空气中的水分,可以将冻干后的样品真空包装,然后常温保存。这样也可抑制样品的氧化和微生物的生长。核酸和蛋白样品冻干后可保存1-4年。冻干RNA通常保存不超过一年。

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二、 生物样品常温保存的优势

相比低温保存,对生物样品进行常温保存有一些明显的优势。首先是费用方面比较合算。样品保存用的超低温、深低温冰箱的购置、维护保养和折旧费用往往相当可观。如果多个冰箱集中放置,还需要专用的空调房间来放置这些冰箱。为了防止供电故障或冰箱故障导致样品被破坏,还需要备用发电设备或备用供电线路,以及备用干冰等物料。此外还可能需要配置温度监控和报警设备。如果用液氮保存,液氮罐的购置、液氮的补充也会产生不菲的费用。有人估计,一份肿瘤样品,冻干保存一年的成本是3欧元,-80℃ 保存的成本是24欧元,液氮保存的成本是31欧元。低温保存的样品往往采用干冰运输,干冰本身的购置费用以及干冰带来的运输重量增加也加大了成本。使用液氮还要顾及到安全问题。大的液氮罐属于压力容器,需要正确处置;液氮温度极低(-196℃),操作失误时可致冻伤。另一方面,使用冰箱对环境的影响也比较大。温度越低,每年所需的二氧化碳的排放量越大。一般家用冰箱年需二氧化碳的排放量约为1700磅,-80℃冰箱为4000磅,而-150℃ 深低温冰箱为15,000磅。

常温保存对空间的利用效率比较高。低温保存设备由于一些制冷、隔热等部件的存在,有效的冷冻空间在整个设备所占空间的比例有时并不高;为了使冰箱正常制冷,冰箱之间需要有足够的距离,以便排热;为了方便取样,液氮罐也不能做得太高。这些因素,都限制了低温设备的空间利用效率,也加大了低温保存的成本。样品进行常温保存时,不存在低温部件对空间的占用,人们可以充分地对储存空间进行合理调配与利用。

三、生物样品的常温保存是今后的发展方向

生物样品常温保存的推广,目前受到一些客观因素的限制。FFPE方法采用的福尔马林,有致癌性,一些人望而生畏,不愿意采用这种方法,而且这种方法有些繁琐。采用福尔马林的安全替代物进行固定,会增加一些费用,在临床认可上也存在着与现有条规不相适应之处。而且,早期采用替代物固定的组织学效果相比用福尔马林稍差一些。 随着新一代测序等技术的发展,对核酸质量的要求更为重要, 因此,尽管组织学固定效果的不尽理想,但由这些替代物固定的样品可以提取出更高质量的核酸(片段化程度较低)。它们的价值将会逐渐显现的。更理想的、新型的福尔马林的替代物需要进一步开发。 

上述的几种常温保存方式,在保存生物样品时,有些方面做不到兼顾。例如,FFPE样品的酶活性受到了破坏;液态稳定液对组织的常温保存时间仍不够长(通常一周);干式化学稳定基质只能分别保存DNA或RNA,不能保存组织;冻干法可以保持组织的酶活性以及形态学特征,但对核酸(尤其是RNA)的保存时间不是太长(RNA保存不超过一年)。因此,需要根据取样的目的,再决定采用哪种保存方式最合理。特别需要指出的是,组织稳定液,例如上海伯豪生物技术有限公司开发出的RNAsafety™组织保存液,也可用于冰箱发生故障时生物组织样品的应急保存。

随着诸多现代医学检测手段的应用和个性化医疗的发展,基础研究和临床检验所收集的生物样品的数量将是巨大的。对它们长期进行低温保存将耗费不少资源和环境成本。开发出低成本的、符合组织学和现代遗传学检测要求的、可长期保存样品的常温保存方发将带来巨大的效益。生物样品的常温保存将是今后的发展方向,因为这种方式节俭、环保。

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